一种异育银鲫尾鳍细胞系的构建方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种异育银鲫尾鳍细胞系的构建方法及其应用，包括：将健康异育银鲫尾鳍的尾鳍剪下，用75％的酒精消毒处理后剪成大小为1‑2mm3的组织块，均匀移植到培养瓶并将培养瓶翻转，置于25℃的恒温培养箱中，6h后加入5mL完全培养液，每3天更换2.5mL完全培养液，细胞汇合至95％以上时加入1mL胰蛋白酶消化液，部分细胞脱落后用完全培养液吹打使细胞重悬，以1：2传代培养，细胞传至10代后将完全培养液的胎牛血清浓度降至10％，再按照上述步骤继续传代培养至细胞系稳定传代；上述异育银鲫尾鳍细胞系能无限传代增殖，可用于分离和鉴定鲤疱疹病毒Ⅱ型。

Construction method and application of caudal fin cell line of Carassius auratus

The invention discloses a method for constructing tail fin cell line of heterotrophic silver crucian carp and its application, which includes: cutting off the tail fin of healthy heterotrophic silver crucian carp, cutting the tail fin into a tissue block of 1 2 mm3 after disinfection with 75% alcohol, evenly transplanting the culture bottle and turning the culture bottle into a constant temperature incubator at 25 C, adding it after 6 hours. 5 ml complete culture medium was replaced every 3 days with 2.5 ml complete culture medium. 1 ml trypsin digestive juice was added when cells were confluent to more than 95%. Some cells were suspended after falling off and blown with complete culture medium. Cells were subcultured in 1:2 passage. The concentration of fetal bovine serum in the complete culture medium was reduced to 10% after 10 passages. These cells can be used for isolation and identification of Cyprinus carpio herpes virus type II.

【技术实现步骤摘要】
一种异育银鲫尾鳍细胞系的构建方法及其应用
本专利技术属于淡水鱼类细胞培养
，具体涉及一种异育银鲫尾鳍细胞系的构建方法及其应用。
技术介绍
利用细胞株来鉴定和分离敏感病毒株是世界动物卫生组织推荐的最有效的病原分离和鉴定方法，建立不同种类的鱼类细胞株可为病毒分离和鉴定提供丰富的生物学材料，也为病毒的疫苗研究奠定基础。目前，已构建的异育银鲫细胞系只有异育银鲫脑细胞系(专利号为US9598671B2)，严重制约了异育银鲫研究的进展。至今为止，只有两株对鲤疱疹病毒Ⅱ型敏感的细胞系，一株是金鱼尾鳍细胞系，另外一株是异育银鲫脑细胞系。现有技术中还没有异育银鲫尾鳍细胞系的构建方法，能用于分离鉴定鲤疱疹病毒Ⅱ型的细胞系也很少，长时间缺少敏感细胞系制约了鲤疱疹病毒Ⅱ型病毒学的研究进展。
技术实现思路
本专利技术的专利技术人经过广泛而深入的研究后发现，异育银鲫尾鳍细胞系是一种能无限传代并可用于鲤疱疹病毒Ⅱ型增殖的永生细胞系。为克服上述现有技术的缺陷，本专利技术的目的在于提供一种异育银鲫尾鳍细胞系的构建方法；本专利技术的第二目的还在于提供上述异育银鲫尾鳍细胞系在分离和鉴定鲤疱疹病毒Ⅱ型上的应用。本专利技术的上述目的通过以下技术方案实现：一种异育银鲫尾鳍细胞系的构建方法，包括以下步骤：(1)原代培养：将健康异育银鲫的尾鳍剪下，用75％酒精消毒处理30s，PBS缓冲液洗三遍，再用镊子轻轻刮除表面黏液，PBS缓冲液洗三遍，然后剪成大小为1-2mm3的组织块，均匀移植到培养瓶，然后将培养瓶翻转，置于25℃的恒温培养箱中，6h后加入5mL完全培养液，每3天更换2.5mL上述完全培养液；(2)传代培养：在显微镜下观察细胞生长情况，待细胞汇合至95％以上时加入1mL胰蛋白酶消化液，有部分细胞脱落后用上述完全培养液吹打使细胞重悬，以1：2(v/v)分瓶传代培养，待细胞传至10代后，将完全培养液的胎牛血清浓度降至10％；然后按照上述步骤继续传代培养，至细胞系稳定传代。步骤(1)中，所述组织块的预处理过程具体为：剪取健康异育银鲫尾鳍，置于含有75％酒精的烧杯中浸泡处理30s，然后用1×PBS缓冲液洗三遍，再用镊子轻轻刮除表面黏液，PBS缓冲液洗三遍，在无菌环境中将清洗后的尾鳍剪成大小为1-2mm3的组织块。进一步地，步骤(1)中，所述完全培养液为15％的胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的M199培养液。进一步地，步骤(1)中，所述培养瓶为25cm2的一次性培养瓶。进一步地，步骤(2)中，所述消化液为质量浓度0.05％的胰蛋白酶消化液。本专利技术的第二方面还在于通过上述构建方法得到的异育银鲫尾鳍细胞系。进一步地，所述的异育银鲫尾鳍细胞系核型为三倍体。本专利技术的第三方面，在于上述异育银鲫尾鳍细胞系在分离和鉴定鲤疱疹病毒Ⅱ型上的应用，具体过程为：从患病的异育银鲫肾脏和脾脏中匀浆提取病毒悬液，然后用病毒悬液孵育细胞，每过24h显微镜下观察一次，记录细胞形态变化；90％的细胞出现病变效应时收获细胞，-80℃下反复冻融三次，然后在转速为5000rpm、温度为4℃离心30min，取上清连续传代20次，再分别利用PCR和实时荧光定量PCR法鉴定鲤疱疹病毒Ⅱ型。与现有技术相比，本专利技术的特点在于：一、本专利技术的构建方法得到的异育银鲫尾鳍细胞系(命名为GiCF)，原代培养的异育银鲫尾鳍细胞形态多样，主要呈上皮样细胞和纤维样细胞特点，稳定传代后细胞呈纤维样细胞特点；且该细胞系在20-30℃温度范围内均可生长，最适生长温度为25℃，染色体数目分布在140-166之间，3n＝156为三倍体。二、用从患病异育银鲫肾脏和脾脏中提取的病毒悬液感染异育银鲫尾鳍细胞系，7天后细胞出现明显的病变现象，细胞收缩、变圆、脱落和细胞质空泡化；病毒传至20代后，感染特征依然稳定，证明异育银鲫尾鳍细胞系对鲤疱疹病毒Ⅱ型敏感，可用于鲤疱疹病毒Ⅱ型的分离和鉴定。附图说明图1为原代培养和传代培养的异育银鲫尾鳍细胞；其中，A：第一代的异育银鲫尾鳍细胞；B：第5代的异育银鲫尾鳍细胞；C：第20代的异育银鲫尾鳍细胞；D：第40代的异育银鲫尾鳍细胞，bar＝200mm；图2为第30代异育银鲫尾鳍细胞在20℃、25℃和30℃条件下的生长特性分析；图3为线粒体16SrRNA鉴定异育银鲫尾鳍细胞的PCR结果图；图4为第30代异育银鲫尾鳍细胞的核型分析；其中，A：第30代异育银鲫尾鳍细胞染色体中期分裂相；B：第30代异育银鲫尾鳍细胞的染色体数分布情况；图5为异育银鲫尾鳍细胞系感染鲤疱疹病毒Ⅱ型后的形态变化；其中，A：正常异育银鲫尾鳍细胞；B：第一代病毒感染异育银鲫尾鳍细胞后7天；C：第一代病毒感染异育银鲫尾鳍细胞后9天；D：第20代病毒感染异育银鲫尾鳍细胞后7天，bar＝200mm；图6为不同代次的鲤疱疹病毒Ⅱ型感染特性鉴定；其中，A：PCR技术鉴定感染2、5、10和20代的鲤疱疹病毒Ⅱ型后，异育银鲫尾鳍细胞中病毒粒子DNA变化情况；B：感染2、5、10和20代的鲤疱疹病毒Ⅱ型后，异育银鲫尾鳍细胞中病毒粒子拷贝数变化情况。具体实施方式下面结合附图给出本专利技术较佳实施例，以详细说明本专利技术的技术方案，但本专利技术的保护范围不限于下述的实施例；以下实施方式中的实验方法如无特殊说明均为常规方法，试剂与材料无特殊说明均市售可得。本专利技术获得的异育银鲫尾鳍细胞系的保藏信息如下：异育银鲫尾鳍细胞系GiCF-LJF-SHOU，分类命名：异育银鲫尾鳍细胞系(Carassiusauratusgibeliocaudalfincell,GiCF)；保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国湖北省武汉市武汉大学；保藏编号：CCTCCNO:C201856；保藏日期：2018年4月9日。实施例1培养异育银鲫尾鳍细胞系采用先原代培养、后传代培养的方式构建异育银鲫尾鳍细胞系，具体步骤为：1)组织块的处理：剪取健康异育银鲫尾鳍，置于含有75％酒精的烧杯中浸泡处理30s，先用1×PBS缓冲液洗三遍，再用镊子轻轻刮除表面黏液后，PBS缓冲液再洗三遍，在无菌环境中将清洗后的尾鳍剪成大小为1-2mm3的组织块。2)原代培养：将上述处理后的组织块均匀移植到25cm2的一次性培养瓶中，然后将培养瓶翻转，置于25℃的恒温培养箱中，6h后加入5mL完全培养液，每3天更换2.5mL完全培养液进行培养。3)传代培养：在显微镜下观察细胞生长情况，待细胞汇合至95％以上时，加入1mL胰蛋白酶消化液，看到有部分细胞脱落后用完全培养液吹打使细胞重悬，以1：2(v/v)分瓶传代培养，待细胞传至10代后，将完全培养液的胎牛血清浓度降至10％，然后按上述条件继续传代培养，如附图1所示。从图中可以看出，原代培养的异育银鲫尾鳍细胞形态多样，主要呈上皮样细胞和纤维样细胞特点，稳定传代后细胞呈纤维样细胞特点，可以看出细胞系构建成功。实施例2异育银鲫尾鳍细胞系的温度敏感性和物种来源分析待上述异育银鲫尾鳍细胞传代至30代后，先将细胞接种至24孔培养板，起始浓度为4×104个细胞每孔，再将培养板分别放置在20℃、25℃和30℃的培养箱中培养，培养1、3、5、7、9天后，分别吸弃旧培养基，用胰蛋白酶消化细胞，调整细胞浓度，然后用血球计数板计数，如附图2所示。从图中可以看出，该细胞系在20-30℃温度本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种异育银鲫尾鳍细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)原代培养：将健康异育银鲫尾鳍的尾鳍剪下，用75％的酒精消毒处理后用镊子刮除表面黏液，然后剪成大小为1‑2mm3的组织块，均匀移植到培养瓶后将培养瓶翻转，并置于25℃的恒温培养箱中，6h后加入5mL完全培养液，每3天更换2.5mL上述完全培养液；(2)传代培养：在显微镜下观察细胞生长情况，待细胞汇合至95％以上时加入1mL胰蛋白酶消化液，部分细胞开始脱落后用上述完全培养液吹打使细胞重悬，以1：2(v/v)分瓶传代培养，细胞传至10代后，将所述完全培养液的胎牛血清浓度降至10％；然后按照上述步骤继续传代培养至细胞稳定传代，得异育银鲫尾鳍细胞系。

【技术特征摘要】
1.一种异育银鲫尾鳍细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)原代培养：将健康异育银鲫尾鳍的尾鳍剪下，用75％的酒精消毒处理后用镊子刮除表面黏液，然后剪成大小为1-2mm3的组织块，均匀移植到培养瓶后将培养瓶翻转，并置于25℃的恒温培养箱中，6h后加入5mL完全培养液，每3天更换2.5mL上述完全培养液；(2)传代培养：在显微镜下观察细胞生长情况，待细胞汇合至95％以上时加入1mL胰蛋白酶消化液，部分细胞开始脱落后用上述完全培养液吹打使细胞重悬，以1：2(v/v)分瓶传代培养，细胞传至10代后，将所述完全培养液的胎牛血清浓度降至10％；然后按照上述步骤继续传代培养至细胞稳定传代，得异育银鲫尾鳍细胞系。2.如权利要求1所述异育银鲫尾鳍细胞系的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述组织块的预处理过程具体为：剪取健康异育银鲫尾鳍，置于含有75％酒精的烧杯中浸泡处理30s，然后用PBS缓冲液洗三遍，在无菌环境中用镊子轻轻刮除表面黏液，再用PBS缓冲液洗三遍，将清洗后的尾鳍剪成大小为1-2mm3的组织块。3.如权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：鲁建飞，吕利群，许丹，费越越，王浩，姜有声，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：上海,31