一种蛹虫草培养基多糖及其分离纯化方法和用途技术

技术编号:18967016 阅读:7 留言:0更新日期:2018-09-19 01:29
本发明专利技术公开了一种蛹虫草培养基多糖及其分离纯化方法和用途,该多糖含有以下摩尔百分比的单糖:0.11%核糖、0.11%鼠李糖、0.45%阿拉伯糖、0.13%木糖、14.50%甘露糖、83.96%葡萄糖、0.73%半乳糖。采用本发明专利技术的提取方法不影响蛹虫草培养基多糖P1的生物活性,所得到的多糖纯品P1纯度高、性质稳定,在抗氧化、降尿酸、抑菌方面具有显著效果,有益于人体代谢;成本较低,多糖P1纯品可进一步用于保健品、药品、化妆品的开发。

Cordyceps militaris culture polysaccharide and its separation and purification method and use

The invention discloses a Cordyceps militaris culture medium polysaccharide and its separation and purification method and application. The polysaccharide contains the following molar percentage monosaccharides: 0.11% ribose, 0.11% rhamnose, 0.45% arabinose, 0.13% xylose, 14.50% mannose, 83.96% glucose and 0.73% galactose. The extracting method of the invention does not affect the biological activity of the polysaccharide P1 of Cordyceps militaris culture medium, and the obtained polysaccharide purity P1 has high purity and stable property, has remarkable effect in antioxidation, hyaluronic acid and bacteriostasis, is beneficial to human metabolism, and has low cost, and the purified polysaccharide P1 can be further used in health care products, medicines and cosmetics. Development.

【技术实现步骤摘要】
一种蛹虫草培养基多糖及其分离纯化方法和用途
本专利技术涉及一种蛹虫草培养基多糖及其分离纯化方法和用途。
技术介绍
多糖(Polysaccharide)又称多聚糖,由醛糖或酮糖通过糖苷键相连接在一起的线性或分枝链状聚合物,是聚合度大于10的极性复杂大分子,分子量一般为数万以上,是构成生命活动的四大基本物质之一,生物体内的多糖除了以游离态存在外,也会与蛋白质或脂肪结合成蛋白多糖和脂多糖。蛹虫草(C.militaris)又称北虫草,分类学上属于子囊菌亚门、核菌纲、球壳菌目,与北冬虫夏草同属麦角科虫草属,主要分布在我国东北、华北、西北等地区。蛹虫草可寄生于鳞翅目、鞘翅目、双翅目等昆虫的幼虫或蛹体上,能采用家蚕蛹、大米培养基等进行人工批量培育。由于天然的蛹虫草资源有限,目前人工栽培的较多,主要有三种培养方法:(1)采集野生的蛹虫草,进行菌种的分离、纯化,然后将蛹虫草菌种接种在含蚕蛹粉的大米等固体培养基上,在一定的温度、湿度和光照条件下,培养35-45d获得蛹虫草子实体;(2)将蛹虫草菌种接种在家蚕幼虫或活蛹体内,在一定的温度、湿度和光照条件下,培养35-45d获得蛹虫草子实体;(3)以大豆粉蔗糖或玉米浆蔗糖为培养基,采用液体发酵培养蛹虫草。我国采用人工方法培养蛹虫草子实体的生产已有相当规模,但在子实体收获的同时,也产生了大量的蛹虫草培养基下脚料,不仅造成环境的污染,也是不可忽视的资源浪费。研究表明,蛹虫草培养基下脚料中含有虫草素、虫草多糖等生物活性物质。因此为了更好地开发利用蛹虫草资源,提高经济效益,完善蛹虫草产业链,对蛹虫草培养基下脚料的利用和研究开发已成为必要。中国专利申请(申请号201110086808.2)公开了一种从蛹虫草培养基中提取多糖的方法,利用不同的酶液来去除蛹虫草培养基中的蛋白、淀粉,再经醇沉得到蛹虫草培养基粗多糖;其操作过程复杂,成本较高,且不能将多糖进一步分离纯化,无法得到纯度较高的多糖组分。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于提供一种蛹虫草培养基多糖。本专利技术的另一目的是提供上述蛹虫草培养基多糖的分离纯化方法,利用超声波辅助水提醇沉法对蛹虫草废弃培养基进行多糖提取,并通过离子交换层析法对多糖进行分离纯化,由此提取分离出纯度较高、具有生物活性的多糖组分。本专利技术的再一目的在于提供上述蛹虫草培养基多糖的用途。本专利技术的目的通过下述技术方案实现:一种蛹虫草培养基多糖,包含以下摩尔百分比的单糖:0.11%核糖、0.11%鼠李糖、0.45%阿拉伯糖、0.13%木糖、14.50%甘露糖、83.96%葡萄糖、0.73%半乳糖;单糖的组成是由GC-MS面积归一化法计算出来的,是除溶剂峰外,把所有的出峰面积看作100%,计算主峰面积占总面积的百分数,可能所测的未知样品里包含了微量的标准品以外的单糖,或是由计算方法造成的偏差,导致该单糖的摩尔百分比组成不足100%,这属于正常情况;所述蛹虫草培养基多糖的平均分子量为2.18kDa;所述的蛹虫草培养基多糖中存在非常微量的硫酸基,还含有吡喃糖环和α-型糖苷键。上述蛹虫草培养基多糖的分离纯化方法,包括以下步骤:(1)提取蛹虫草培养基多糖:将蛹虫草大米培养基下脚料干燥后粉碎,过筛得下脚料干粉;称取干粉加入15-16倍质量的蒸馏水,超声波处理30min以上,在70℃下回流提取1.5-2.0h,提取若干次合并提取液,提取液过滤后浓缩,得到多糖浓缩液;在多糖浓缩液中加入3-4倍体积的95%(V/V)乙醇,搅拌后于4℃中静置过夜;离心后将沉淀烘干得到蛹虫草培养基多糖提取物;步骤(1)所述的过筛优选过40目筛;步骤(1)所述的浓缩优选在50-55℃下浓缩;步骤(1)所述的离心优选5000r/min离心15min;(2)蛹虫草培养基多糖的脱色:将蛹虫草培养基多糖提取物加蒸馏水溶解,调节pH值至8.0-8.5,滴加H2O2溶液至无色,50-55℃保温2h以上;步骤(2)所述的H2O2溶液,浓度优选30%(V/V);(3)酶法结合Sevage法脱蛋白:3-1:将木瓜蛋白酶溶液与蛹虫草培养基多糖提取液混合,两者的体积比为1.0:1.5~1.0:1.7,60-70℃酶解2-3h;所述的木瓜蛋白酶溶液用pH值6.0的PBS缓冲液配制而成,其中木瓜蛋白酶的浓度优选250U/ml;3-2:在酶解液中加入1/5体积的Sevage试剂,振荡培养30min以上,然后多次离心直至无蛋白沉淀析出为止,取上清液,烘干得到蛹虫草培养基粗多糖;步骤(3)所述的Sevage试剂,是氯仿和正丁醇按体积比5:1配制而成;步骤(3)所述的振荡培养,摇床转速优选150r/min;步骤(3)所述的离心优选4000r/min离心20-30min;(4)蛹虫草培养基多糖的分离纯化:将蛹虫草培养基粗多糖用蒸馏水溶解后上DEAE琼脂糖凝胶FF(DEAESephroseFastFlow)离子交换层析柱,用蒸馏水进行洗脱,得到所述的蛹虫草培养基多糖P1。多糖的分离纯化不仅是一个除杂的过程,同时也是将混合多糖分离为单一组分的过程。柱层析法可分为离子交换层析和凝胶柱层析。离子交换层析是依据离子电荷密度的不同而进行分级分离,阴离子交换剂的电荷基团带正电,反离子带负电,因此这种交换剂可以与溶液中的负电荷化合物或阴离子进行交换反应,而阳离子交换剂则反之。本专利技术的蛹虫草培养基多糖可以作为抗氧化剂或抑菌剂应用,也可以用于制备具有降尿酸功效的药物。本专利技术通过水提醇沉法得到蛹虫草培养基粗多糖,利用离子交换层析柱进行粗多糖的分离纯化,相对于现有技术具有如下的优点及效果:(1)本专利技术充分利用了培养蛹虫草而产生的培养基下脚料,符合变废为宝的绿色环保理念,建立了一条完整可行的蛹虫草培养基多糖提取、分离纯化、理化性质、结构和生物活性研究的技术路线,完善了人工培养蛹虫草产业的残渣处理工艺,为食用菌多糖的提取分离纯化提供了技术指导。(2)本专利技术所用的水提醇沉法可以完成大通量的多糖提取操作,成本较低,重复性好,得率高,适用于工业化大规模生产。(3)本专利技术所用的DEAESephroseFastFlow理化稳定性和机械性能更好,交换容量大,可以在位清洗,床体积随pH的离子强度变化很小,由于流速和载量高,适合于进行大量粗产品的纯化工作。(4)采用本专利技术的提取方法不影响蛹虫草培养基多糖P1的生物活性,所得到的多糖纯品P1纯度高、性质稳定,在抗氧化、降尿酸、抑菌方面具有显著效果,有益于人体代谢;成本较低,多糖P1纯品可进一步用于保健品、药品、化妆品的开发。(5)本专利技术创造性地将多糖的水提醇沉提取方法与离子交换层析分离纯化方法结合起来用于蛹虫草培养基下脚料多糖的研究,比较并得到较优的工艺参数,并确定DEAESephroseFastFlow作为层析柱填料,为蛹虫草培养基下脚料多糖的提取分离纯化提供技术指导和新思路。附图说明图1是蛹虫草培养基多糖的洗脱曲线图。图2是多糖P1的紫外光谱图。图3是多糖P1的红外光谱图。图4是多糖P1的ABTS自由基清除能力。图5是多糖P1的OH自由基清除能力。图6是多糖P1的抑菌实验结果图;其中,Sa-对金黄色葡萄球菌的抑菌圈,Pa-对绿脓杆菌的抑菌圈,1-多糖P1产生的抑菌圈,0-对照组的抑菌圈。具体实施方式下面结合实施例及附图对本专利技术作进一步详细本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种蛹虫草培养基多糖,其特征在于含有以下摩尔百分比的单糖:0.11%核糖、0.11%鼠李糖、0.45%阿拉伯糖、0.13%木糖、14.50%甘露糖、83.96%葡萄糖、0.73%半乳糖。

【技术特征摘要】
1.一种蛹虫草培养基多糖,其特征在于含有以下摩尔百分比的单糖:0.11%核糖、0.11%鼠李糖、0.45%阿拉伯糖、0.13%木糖、14.50%甘露糖、83.96%葡萄糖、0.73%半乳糖。2.根据权利要求1所述的蛹虫草培养基多糖,其特征在于:平均分子量为2.18kDa。3.根据权利要求1所述的蛹虫草培养基多糖,其特征在于:含有硫酸基、吡喃糖环和α-型糖苷键。4.权利要求1-3任一项所述的蛹虫草培养基多糖的分离纯化方法,其特征在于包括以下步骤:(1)提取蛹虫草培养基多糖:将蛹虫草大米培养基下脚料干燥后粉碎,过筛得下脚料干粉;称取干粉加入15-16倍质量的蒸馏水,超声波处理30min以上,在70℃下回流提取1.5-2.0h,提取若干次合并提取液,提取液过滤后浓缩,得到多糖浓缩液;在多糖浓缩液中加入3-4倍体积的95%(V/V)乙醇,搅拌后于4℃中静置过夜;离心后将沉淀烘干得到蛹虫草培养基多糖提取物;(2)蛹虫草培养基多糖的脱色:将蛹虫草培养基多糖提取物加蒸馏水溶解,调节pH值至8.0-8.5,滴加H2O2溶液至无色,50-55℃保温2h以上;(3)酶法结合Sevage法脱蛋白:3-1:将木瓜蛋白酶溶液与蛹...

【专利技术属性】
技术研发人员:黄儒强张竞雯王静辉王倩高林林
申请(专利权)人:华南师范大学
类型:发明
国别省市:广东,44

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