一种生物膜包裹的多模态肿瘤造影剂及其制备方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种生物膜包裹的多模态肿瘤造影剂及其制备方法与应用。所述的生物膜包裹的多模态肿瘤造影剂，包括生物膜和包裹于生物膜中的超顺磁性四氧化三铁的铁蛋白纳米笼(M‑HFn)和荧光染料，其中的超顺磁性四氧化三铁的铁蛋白纳米笼与荧光染料连接形成荧光染料‑M‑HFn复合物，构建得到用于体内的仿生纳米生物膜载体递送体系，可实现体内长循环，增强对肿瘤靶向性，减少非特异性积累，降低对正常组织的损害，同时增强造影效果。本发明专利技术还提供了本发明专利技术所述的生物膜包裹的多模态肿瘤造影剂的制备方法，在临床肿瘤学早期诊疗等领域拥有重要的应用前景和研究价值。

A biomembrane multimodal tumor contrast agent and its preparation and Application

The invention provides a multi-modal tumor contrast agent coated with biological membrane and a preparation method and application thereof. The biofilm-encapsulated multimodal tumor contrast agent comprises a biofilm and a superparamagnetic ferritin nanocage (M_HFn) encapsulated in the biofilm and a fluorescent dye. The superparamagnetic ferritin nanocage of the biofilm is connected with a fluorescent dye to form a fluorescent dye_M_HFn complex, and is constructed. Biomimetic nano-biofilm carrier delivery system for in vivo can achieve long-term in vivo circulation, enhance tumor targeting, reduce non-specific accumulation, reduce damage to normal tissues, and enhance imaging effect. The invention also provides a preparation method of the biofilm-encapsulated multimodal tumor contrast agent, which has an important application prospect and research value in the field of early diagnosis and treatment of clinical oncology.

【技术实现步骤摘要】
一种生物膜包裹的多模态肿瘤造影剂及其制备方法与应用
本专利技术属于核磁共振造影剂领域，特别涉及一种生物膜包裹的多模态肿瘤造影剂及其制备方法与应用。
技术介绍
癌症是威胁全球人类生命的最大杀手之一，是医学研究领域所面临的一项重大挑战。核磁共振成像已经成为原发肿瘤和转移瘤诊断中重要的依据。目前肿瘤检测手段的特异性和灵敏度较低，无法同时实现对肿瘤细胞特异性识别和药物的可控输运。随着纳米科技的不断发展，纳米荧光探针已经被广泛应用于化学、生物学、医学等领域，尤其是肿瘤的诊断、成像及治疗。高灵敏度、高选择性地对多种肿瘤标志物进行检测和成像是当前研究的热点和难点，而将多组分检测的策略应用于生物模型中，实现动态实时的对活细胞内多种物质的监测对于肿瘤诊断具有重大意义。基于纳米材料的新型药物及技术为重大疾病的预防、诊断与治疗提供了新的思路。研究人员相继提出了一系列可以用于癌症早期诊断和治疗的纳米平台，具有肿瘤靶向输运标记功能的纳米材料为实现癌症的早期诊断和治疗带来了新的希望。在这些纳米材料中，铁蛋白纳米粒子具有独特的八面体结构，可用于装载多种抗癌药物和成像探针分子等方面优点吸引了人们的广泛关注。然而，现有造影剂(如：Gd-DTPA)主要是经呈高渗透状态的肿瘤血管，被动扩散到肿瘤组织的细胞间质，这造成铁蛋白体系对肝肾等正常组织的非特异性积累、表面生物功能化后的稳定性差、难以达到令人满意的对比成像效果等等。因此，迫切需要进一步系统化的开展具有多重功能的特异性生物分子介导复合纳米粒子，实现体外对肿瘤细胞的靶向标记和治疗，增强此类纳米载体在微小肿瘤病灶处的标记效果，尽早应用于临床诊断研究。研究人员在转换发光纳米粒子的合成与制备、表面修饰改性、生物功能化、生物安全性、细胞标记、活体成像、多模态成像、光动力治疗、以及成像引导下的癌症治疗等许多领域展开了一系列深入的研究和探索。总体来看，目前尚缺乏理想的、特异性强的早期诊断方法，尤其对深层肿瘤的早期诊断更为困难。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种生物膜包裹的多模态肿瘤造影剂。本专利技术通过生物膜包裹近红外荧光探针、M-HFn的超顺磁性四氧化三铁的铁蛋白纳米笼和抗肿瘤药物，构建一种用于体内的仿生纳米生物膜载体递送体系，主动靶向至肿瘤组织实现功能化，在临床肿瘤学早期诊疗等领域拥有重要的应用前景和研究价值。本专利技术的另一目的在于提供所述的生物膜包裹的多模态肿瘤造影剂的制备方法。本专利技术的再一目的在于提供所述的生物膜包裹的多模态肿瘤造影剂的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种生物膜包裹的多模态肿瘤造影剂，包括生物膜和包裹于生物膜中的超顺磁性四氧化三铁的铁蛋白纳米笼(M-HFn)和荧光染料，其中的超顺磁性四氧化三铁的铁蛋白纳米笼与荧光染料连接形成荧光染料-M-HFn复合物。所述的超顺磁性四氧化三铁的铁蛋白纳米笼优选通过如下方法制备得到：在惰性气氛下，将人FTH1蛋白与脱气NaCl溶液混合在65℃±3℃下反应，然后同时恒速加入pH8±1的脱气硫酸亚铁铵、脱气过氧化氢溶液与NaOH溶液，反应至少持续5min，加入柠檬酸钠；超滤离心或透析，制得所述的载铁铁蛋白纳米粒子。所述的生物膜优选为红细胞膜、白细胞膜、血小板膜中的至少一种；进一步优选为红细胞膜。所述的荧光染料优选为Cy5.5。所述的人FTH1蛋白可通过基因工程技术制备或通过市售途径购买得到。所述的生物膜包裹的多模态肿瘤造影剂的表面还可以连接磷脂-聚乙二醇-靶向分子，进一步实现靶向。所述的靶向分子优选为Angiopep-2、RGD多肽、叶酸、整合素、新生血管靶向肽中的至少一种。所述的生物膜包裹的多模态肿瘤造影剂的制备方法，包括如下步骤：(1)将荧光染料与超顺磁性四氧化三铁的铁蛋白纳米笼混合孵育过夜，纯化后得到所述的荧光染料-M-HFn复合物；(2)将步骤(1)制得的荧光染料-M-HFn复合物加入到红细胞膜的低渗溶液中孵育，离心取沉淀，得到负载荧光染料-M-HFn复合物的红细胞血影悬浮液，将红细胞血影依次通过400nm，200nm，100nm或50nm脂质体制备仪器反复挤压成型，即得所述的生物膜包裹的多模态肿瘤造影剂。步骤(1)中所述的纯化优选为柱层析纯化。当所述的生物膜包裹的多模态肿瘤造影剂表面还连接磷脂-聚乙二醇-靶向分子时，将所述的生物膜包裹的多模态肿瘤造影剂混合孵育，得到靶向生物膜包裹的多模态肿瘤造影剂。所述的生物膜包裹的多模态肿瘤造影剂作为载体材料或制备靶向药物中的应用。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：(1)本专利技术通过生物膜包裹Cy5.5-M-HFn，可实现体内长循环，增强对肿瘤靶向性，减少非特异性积累，降低对正常组织的损害，同时增强造影效果。相比于传统单一功能的造影剂，本专利技术通过多模态成像提高组织穿透性以及被靶细胞摄取的能力，突破多重生理屏障，实现对肿瘤组织的长效靶向递送，可避免单一检测造成的假阳性结果。(2)Cy5.5荧光染料与Fe3O4磁性纳米粒子用于癌症诊疗，多模态成像剂提高组织穿透性以及被靶细胞摄取的能力，突破多重生理屏障，可实现在治疗过程中通过分子成像实时了解药物分布、吸收情况，监测靶向治疗效果。(3)用磷脂-聚乙二醇-靶向分子(如RGD)修饰的红细胞膜包裹铁蛋白笼和抗癌药物复合体系，有效地保护载体内核，有利于靶向肿瘤组织和细胞并降低对正常组织的影响，在癌症诊疗中具有极大的应用前景。附图说明图1是实施例1的靶向造影剂的透射电子显微镜照片图。图2是不同加载量的超顺磁性四氧化三铁的铁蛋白纳米笼的稳定性结果分析图。图3是不同浓度下的超顺磁性四氧化三铁的铁蛋白纳米笼的细胞毒性(B16F10)结果分析图。图4是造影剂超顺磁特性检测结果分析图。图5是实施例1的造影剂作用B16F10细胞的激光共聚焦显微镜照片图。图6是实施例1制得的造影剂在小鼠皮下肿瘤中的NIR成像图。图7是实施例1制得的造影剂在小鼠皮下肿瘤中的MRI成像图。图8是受试小鼠主要器官和肿瘤组织切片照片图，从左到右依次是心脏、肝脏、脾脏、肺部、肾脏、肿瘤组织的切片。具体实施方式下面结合实施例及附图对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。实施例1黑色素瘤靶向造影剂的制备(1)制备超顺磁性铁蛋白纳米笼(HFn)表达超顺磁性铁蛋白纳米笼的阳性菌株由湖北百奥斯生物科技有限公司进行构建，该公司提供质粒构建等服务，细胞亦来源于该公司。提取人骨骼肌细胞RNA，反转录成cDNA作为模板；扩增人FTH1基因，PCR引物如下(黑色下划线为酶切位点)F:5’AGTCGCCCATATGACGACCGCGTCC3’(NdeI)R:5’GCCGGATCCTTAGCTTTCATTATCAC3’(BamHI)将PCR产物纯化回收后，经双酶切与pET-30a(+)载体连接，产物转化XL2-Blue感受态细胞，经Kan+抗性平板筛选，挑菌落鉴定后送至测序。将测序正确的质粒再转入感受态BL21(DE3)E.Coli中，筛选出阳性菌株。将阳性菌株加入1L含30mg/LKan的LB培养基过夜培养，加入1mM的IPTG诱导4h后，离心收集菌体，用45mL的裂解液(100mMHEPES,50mMNaCl,pH8.0)重悬沉淀，并分别加入溶菌酶、DNAse和R本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生物膜包裹的多模态肿瘤造影剂，其特征在于：包括生物膜和包裹于生物膜中的超顺磁性四氧化三铁的铁蛋白纳米笼和荧光染料，其中的超顺磁性四氧化三铁的铁蛋白纳米笼与荧光染料连接形成荧光染料‑M‑HFn复合物。

【技术特征摘要】
1.一种生物膜包裹的多模态肿瘤造影剂，其特征在于：包括生物膜和包裹于生物膜中的超顺磁性四氧化三铁的铁蛋白纳米笼和荧光染料，其中的超顺磁性四氧化三铁的铁蛋白纳米笼与荧光染料连接形成荧光染料-M-HFn复合物。2.根据权利要求1所述的生物膜包裹的多模态肿瘤造影剂，其特征在于，所述的超顺磁性四氧化三铁的铁蛋白纳米笼通过如下方法制备得到：在惰性气氛下，将人FTH1蛋白与脱气NaCl溶液混合在65℃±3℃下反应，然后同时恒速加入pH8±1的脱气硫酸亚铁铵、脱气过氧化氢溶液与NaOH溶液，反应至少持续5min，加入柠檬酸钠；超滤离心或透析，制得所述的载铁铁蛋白纳米粒子。3.根据权利要求1所述的生物膜包裹的多模态肿瘤造影剂，其特征在于：所述的生物膜为红细胞膜、白细胞膜、血小板膜中的至少一种。4.根据权利要求1所述的生物膜包裹的多模态肿瘤造影剂，其特征在于：所述的生物膜为红细胞膜；所述的荧光染料为Cy5.5。5.根据权利要求1～4任一项所述的生物膜包裹的多模态肿瘤造影剂，其特征在于：所述的生物膜包裹的多模态肿瘤造影剂的表面连接磷脂-聚乙二醇-靶向分子。6.根据权利要求5所述的所述的生物膜包裹的多模态肿瘤造影剂，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴箭，宋镕光，阮淼亮，薛巍，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东,44