一种新型抗菌鱼饲料的制备方法技术

本发明专利技术公开的事一种新型抗菌鱼饲料的制备方法，属于生物工程技术领域，该方法包括获取目的基因片段、构建重组表达质粒、制备重组蛋白以及重组蛋白与鱼饲料的混合，本发明专利技术成功构建了重组原核表达质粒，成功获得重组蛋白可溶性表达，明确该蛋白具有抑菌效果，将其运用于鱼饲料的制备中，解决了鱼类养殖过程中存在的死亡率高、污染大等问题，具有广阔的应用前景。

Preparation of a new antibacterial fish feed

The invention discloses a novel preparation method for antibacterial fish feed, which belongs to the field of bioengineering technology. The method comprises acquiring target gene fragment, constructing recombinant expression plasmid, preparing recombinant protein and mixing the recombinant protein with fish feed. The Recombinant Prokaryotic expression plasmid is successfully constructed and the recombinant expression plasmid is successfully obtained. Soluble protein expression, make it clear that the protein has antimicrobial effect, and apply it to the preparation of fish feed, solve the problems of high mortality and pollution in the process of fish culture, has broad application prospects.

【技术实现步骤摘要】
一种新型抗菌鱼饲料的制备方法
本专利技术涉及一种鱼饲料的制备方法，更具体一点说，涉及一种新型抗菌鱼饲料的制备方法，属于生物工程

技术介绍
目前，市场上的鱼饲料普遍使用抗生素作为饲料添加剂以降低鱼养殖过程的死亡率，但是由于抗生素的大量使用导致其大量残留于鱼的体内，既影响鱼的出口市场，也影响鱼养殖业本身发展，对抗生素的滥用不仅增强了鱼的抗药性，还对水质造成了严重的污染。因此，市场上急需一种鱼饲料可以与细菌、病毒或毒素等异源性物质结合而发挥预防和治疗鱼类疾病的作用，并且绿色、安全，无污染无残留无公害，可显著缓解目前鱼类养殖过程中存在的问题。条纹斑竹鲨(Chiloscylliumplagiosum)俗称狗鲨、犬鲨，属于软骨鱼纲(Chondrichthyes)、须鲨目(Orectolformes)须鲨科(Orectolebidea)、斑竹鲨属(Chiloscyllium)，是一种小型底栖颌类脊椎动物，早在5.3亿年前便存在，是硬骨鱼类的祖先。它具有软骨鱼类和硬骨鱼类共有的特性，即复杂的生理系统、适应性免疫系统和加压循环系统，条纹斑竹鲨具有较强的免疫系统，其体内会产生一种只含有重链的抗体，称为单域抗体，与传统抗体不同的是单域抗体仅是一个通过铰链区与Fc区连接的抗原结合部位，这个抗原结合区自抗体分离后仍具有结合抗原的功能，并且具有稳定性高、渗透性好的特点，因此，通过筛选条纹斑竹鲨的基因，构建表达质粒，在原核微生物中表达纯化，获得具有抗菌效果的蛋白，并将其作为添加剂加入鱼饲料中可以获得一种新型抗菌鱼饲料。
技术实现思路
本专利技术的目的在于解决上述技术问题，提供具有绿色、安全、无污染、无残留无公害，且可以预防和治疗鱼类疾病等技术特点的一种新型抗菌鱼饲料的制备方法，一种新型抗菌鱼饲料的制备方法，该制备方法包括如下步骤：步骤一：确定基因cp2-2酶切位点和引物，所述引物包括上游引物为5’-CGAGCTCCGAGTGCCCAAAATCA-3’和下游引物为5’-ACTCGAGTCAGTCAAATCTTTTGC-3’，从条纹斑竹鲨脾脏提取RNA，利用引物进行特异性扩增，得到cp2-2目的片段；步骤二：将步骤一获得的cp2-2目的片段与质粒pET-32a的菌株扩大培养后提取质粒DNA，将质粒DNA分别用SacI和XhoI双酶切、纯化回收，将回收得到的cp2-2目的片段和载体片段pET-32a连接，获得连接产物；步骤三：取5μL步骤二获得的连接产物转化至200μL大肠杆菌Rossetta感受态细胞中，吹打混匀，再依次进行冰浴30min，42℃热击90s，冰浴5min，然后加入LB液体培养基1mL，37℃摇床1h后，经Amp和CM抗性LB固体培养基筛选阳性克隆，经鉴定后得到重组表达质粒pET-32a-cp2-2；步骤四：将步骤二获得的重组表达质粒pET-32a-cp2-2进行重组蛋白诱导表达，再进行纯化、鉴定，获得cp2-2重组蛋白；步骤五：将步骤四获得的cp2-2重组蛋白添加到普通的鱼饲料中，搅拌均匀，获得一种新型抗菌鱼饲料。作为一种改进，步骤三中重组质粒pET-32a-cp2-2的鉴定方法包括质粒PCR鉴定、双酶切鉴定和测序鉴定，先选取菌液提取质粒DNA，对提取的质粒DNA分别进行质粒PCR和用SacI和XhoI进行双酶切鉴定，然后选取经质粒PCR和双酶切鉴定均正确的菌株进行测序鉴定。作为一种改进，步骤四中重组蛋白诱导表达为在28℃条件下，利用浓度为1mM/L的IPTG诱导4h。作为一种改进，所述步骤四中纯化方法为Ni柱亲和层析挂柱纯化。有益效果：具有绿色、安全、无污染、无残留、无公害优点；可以预防和治疗鱼类疾病，降低养殖户的损失，有利于鱼养殖业发展；可批量生产。附图说明图1为本专利技术cp2-2基因PCR扩增图。图2为本专利技术含有重组质粒pET-32a-cp2-2菌体的阳性克隆质粒PCR鉴定图。图3为用SacI和XhoI双酶切鉴定结果图。图4为本专利技术cp2-2重组蛋白表达图。图5为本专利技术cp2-2重组蛋白纯化鉴定图。具体实施方式以下结合说明书附图对本专利技术具体的实施例做进一步解释，但本专利技术并不局限于以下实施例。一种新型抗菌鱼饲料的制备方法，该制备方法包括如下步骤：步骤一：确定基因cp2-2酶切位点和引物，所述引物包括上游引物为5’-CGAGCTCCGAGTGCCCAAAATCA-3’和下游引物为5’-ACTCGAGTCAGTCAAATCTTTTGC-3’，其中所述上游引物序列见(说明书核苷酸和氨基酸序列表<400>2)SEQIDNO:2所示，所述下游引物序列见(说明书核苷酸和氨基酸序列表<400>3))SEQIDNO:3所示，从条纹斑竹鲨脾脏提取RNA，利用上、下游引物进行特异性扩增，得到cp2-2目的片段；其中，提取条纹斑竹鲨脾脏RNA：采用试剂盒mRNAIsolationKit提取条纹斑竹鲨脾脏RNA，具体操作步骤如下：1)制备10μl体系：包括4μl的RNA/mRNA(条纹斑竹鲨脾脏RNA)，2μl的5xqRTSuperMix(预混液)，4μl的Nase-freeWaterR；2)将RNA逆转录成cDNA：将上述10μl体系依次置于25℃条件下10min，42℃条件下30min，85℃条件下5min，使得RNA逆转录成cDNA。其中，cp2-2特异性扩增为PCR扩增，图1所示为cp2-2基因PCR扩增图，图1中，M:2，000Marker、1:cp2-2PCR，PCR扩增具体操作步骤如下：1)制备50μl体系：包括5μl的10×Buffer(缓冲液)，5μl的dNTP(ACTG),3μl的Mg2+(缓冲液)，2μl的P1(上游引物)，2μl的P2(下游引物)，1μl的Term，1μl的Taq(酶)以及31μl的ddH2O(水)；2)将上述50μl体系依次序置于95℃条件下10min，95℃条件下30s，58℃条件下30s，72℃条件下60s，72℃条件下10min，10℃条件下保存，变性、退火、延伸30个循环；步骤二：将步骤一获得的cp2-2目的片段和质粒pET-32a的菌株扩大培养后提取质粒DNA，将质粒DNA分别用SacI和XhoI双酶切、纯化回收，将回收得到的cp2-2目的片段和载体片段pET-32a连接，获得连接产物；其中，载体双酶切：将pET-32a的菌株在含Amp和CM的LB液体培养基37℃摇床过夜培养，所得菌液用AxyPrep质粒DNA小量试剂盒提取质粒DNA，然后用SacI和XhoI双酶切，具体操作步骤如下：1)制备体系：包括300.8ng/μl的pET-32a(载体)，2μl的SacI，2μl的XhoI，5μl的10xBuffer，6μl的质粒以及35μlddH2O；2)将上述体系放置37℃条件下3h。上述酶切产物需经琼脂糖凝胶电泳，并按载体的大小，对凝胶上的片段进行切割，根据AxyPrepDNAGELExtretionKit试剂盒步骤进行纯化回收操作。其中，将cp2-2目的片段用SacI和XhoI双酶切，具体包括如下步骤：1)制备50μl体系：包括5μl的10×QCutBuffer，2μl的SacⅠ，2μl的XholⅠ，41μl的cp2-2；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种新型抗菌鱼饲料的制备方法，其特征在于该制备方法包括如下步骤：步骤一：确定基因cp2‑2酶切位点和引物，所述引物包括上游引物为5’‑CGAGCTCCGAGTGCCCAAAATCA‑3’和下游引物为5’‑ACTCGAGTCAGTCAAATCTTTTGC‑3’，从条纹斑竹鲨脾脏提取RNA，利用引物进行特异性扩增，得到cp2‑2目的片段；步骤二：将步骤一获得的cp2‑2目的片段与质粒pET‑32a的菌株扩大培养后提取质粒DNA，将质粒DNA分别用SacI和XhoI双酶切、纯化回收，将回收得到的cp2‑2目的片段和载体片段pET‑32a连接，获得连接产物；步骤三：取5μL步骤二获得的连接产物转化至200μL大肠杆菌Rossetta感受态细胞中，吹打混匀，再依次进行冰浴30min，42℃热击90s，冰浴5min，然后加入LB液体培养基1mL，37℃摇床1h后，经Amp和CM抗性LB固体培养基筛选阳性克隆，经鉴定后得到重组表达质粒pET‑32a‑cp2‑2；步骤四：将步骤二获得的重组表达质粒pET‑32a‑cp2‑2进行重组蛋白诱导表达，再进行纯化、鉴定，获得cp2‑2重组蛋白；步骤五：将步骤四获得的cp2‑2重组蛋白添加到普通的鱼饲料中，搅拌均匀，获得一种新型抗菌鱼饲料。...

【技术特征摘要】
1.一种新型抗菌鱼饲料的制备方法，其特征在于该制备方法包括如下步骤：步骤一：确定基因cp2-2酶切位点和引物，所述引物包括上游引物为5’-CGAGCTCCGAGTGCCCAAAATCA-3’和下游引物为5’-ACTCGAGTCAGTCAAATCTTTTGC-3’，从条纹斑竹鲨脾脏提取RNA，利用引物进行特异性扩增，得到cp2-2目的片段；步骤二：将步骤一获得的cp2-2目的片段与质粒pET-32a的菌株扩大培养后提取质粒DNA，将质粒DNA分别用SacI和XhoI双酶切、纯化回收，将回收得到的cp2-2目的片段和载体片段pET-32a连接，获得连接产物；步骤三：取5μL步骤二获得的连接产物转化至200μL大肠杆菌Rossetta感受态细胞中，吹打混匀，再依次进行冰浴30min，42℃热击90s，冰浴5min，然后加入LB液体培养基1mL，37℃摇床1h后，经Amp和CM抗性LB固体培养基筛选阳性克隆，经鉴定后得到重组表达质粒pE...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕正兵，任清榆，陈剑清，靳洋洋，唐玲，王师北，崔轩，吴溢鑫，
申请(专利权)人：浙江理工大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33