本发明专利技术公开了一种PEDV和TGEV的二重RT‑PCR检测的引物序列，所述PEDV的引物序列为序列1：ATGCTACAATTAGTGAATG，SEQ ID NO:1序列2：TTATACGTCAATAACAGTAC，SEQ ID NO:2；所述TGEV的引物序列序列3：TAGACAAACTCGCTATCGCA，SEQ ID NO:3；序列4:TTCTATCTGGTCGCCATCTT，SEQ ID NO:4；二重RT‑PCR检测方法，包括以下步骤：步骤(1)：从猪肠道组织样品中提取总RNA；步骤(2)：将步骤(2)中提取的总RNA反转录为cDNA，以cDNA为模板并采用引物序列进行PCR反应，获得PCR产物；将PCR产物经过琼脂糖胶电泳后，用GeL Doc TMXR紫外凝胶成像系统观察成像并拍照。本发明专利技术中通过二重RT‑PCR的检测方法，且改变PCR的反应程序，能够快速且精确的检测并分辨出PEDV及TGEV的方法。
【技术实现步骤摘要】
一种PEDV和TGEV引物序列及二重RT-PCR的检测方法
本专利技术涉及生物
，更具体的说是涉及一种PEDV和TGEV引物序列及二重RT-PCR的检测方法。
技术介绍
猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(transmissiblegastroenteritisvirus,TGEV)是引起猪病毒性腹泻的主要病原，均具有较强的传染性，尤其以哺乳仔猪的易感性最强，致死率高。两种病毒均属于冠状病毒属成员，在致病性和流行病学上极为相似，以呕吐、腹泻、脱水为主要特征，病理变化相似，临床上不易分辨。两种病毒极易感染仔猪，具有相似的临床症状、流行病学和病理变化，并常常出现混合感染。因此，仅仅依靠临床观察难以将其区分，需要结合实验室诊断。近年来，PEDV在我国多个省市的发病率呈上升趋势，是困扰养猪业的主要疾病之一。自2010年冬季以来，我国10多个省市爆发PEDV，病猪表现出水样腹泻、急性肠炎、呕吐等典型症状，死亡率极高，给我国养猪业造成重创，引起了养猪业的高度重视。这次疫情的主要致病原是PEDV，然而，从一些病死猪体内也分离出TGEV。因此，研究一种高效、快捷的诊断技术来区分PEDV和TGEV是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种根据PEDVE基因序列及TGEVN基因分别设计PEDV及TGEV的引物，通过采用二重RT-PCR的检测方法能够高效、快捷的分辨出PEDV和TGEV。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种PEDV和TGEV的二重RT-PCR检测的引物序列，PEDV的引物序列为序列1：ATGCTACAATTAGTGAATG，SEQIDNO:1；序列2：TTATACGTCAATAACAGTAC，SEQIDNO:2；TGEV的引物序列序列3：TAGACAAACTCGCTATCGCA，SEQIDNO:3；序列4:TTCTATCTGGTCGCCATCTT，SEQIDNO:4。优选地，PEDV及TGEV的引物序列根据PEDVE基因序列及TGEVN基因设计获得。本专利技术还提供一种对于PEDV和TGEV的二重PT-PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤(1)：从猪肠道组织样品中提取总RNA；步骤(2)：将步骤(2)中提取的总RNA反转录为cDNA，以cDNA为模板并采用引物序列进行PCR反应，获得PCR产物；将PCR产物经过琼脂糖胶电泳后，用GeLDocTMXR紫外凝胶成像系统观察成像并拍照。本专利技术有益效果：本专利技术中通过采用根据PEDVE基因序列及TGEVN基因分别设计PEDV及TGEV的引物序列，通过二重PT-PCR的检测方法，且改变PCR的反应程序，获得了一种能够快速且精确的检测并分辨出PEDV及TGEV的方法。优选地，步骤(3)中所述PCR反应程序为90℃-95℃预变性2-3min；92℃-95℃变性26-32s；48℃-62℃退火26-30s；70℃-73℃延伸1-3min；共35个循环；最后70℃-73℃延伸6-10min；在3℃-5℃保存。优选地，步骤(3)中所述PCR反应程序为94℃预变性3min；94℃变性30s；58.1℃退火30s；72℃延伸1min；共35个循环；最后72℃延伸7min；在4℃-5℃保存。优选地，步骤(2)中所述猪肠道组织样品选自猪粪便和小肠组织。优选地，步骤(3)中所述琼脂糖胶为1％-3％的琼脂糖胶，所述电泳电压为110V，电泳时间为30-35min。经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术公开提供了一种猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二重RT-PCR的检测方法，通过采用本专利技术中的两种引物经过PCR反应，高效、快捷的分辨出PEDV和TGEV。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。图1附图为本专利技术中实施例1-8中的PCR产物经琼脂糖凝胶的电泳图；图2附图为本专利技术中对比例1中的PCR产物经琼脂糖凝胶的电泳图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术实施例公开了一种对于PEDV和TGEV的二重PT-PCR检测方法。实施例1对于PEDV和TGEV的二重RT-PCR检测方法，包括以下步骤：步骤(1)：根据PEDVE基因序列设计PEDV引物序列如下：PEDV的引物序列为序列1：ATGCTACAATTAGTGAATG，SEQIDNO:1；序列2：TTATACGTCAATAACAGTAC，SEQIDNO:2；根据TGEVN基因设计TGEV引物序列如下：TGEV的引物序列为序列3：TAGACAAACTCGCTATCGCA，SEQIDNO:3；序列4:TTCTATCTGGTCGCCATCTT，SEQIDNO:4；步骤(2)：采用RNA小量制备试剂盒，从猪肠道组织中提取总RNA；步骤(3)：将步骤(2)中提取的总RNA反转录为cDNA，以cDNA为模板进行PCR反应，获得PCR产物；PCR反应程序为94℃预变性3min；94℃变性30s；48.0℃退火30s；72℃延伸1min；共35个循环；最后72℃延伸7min；在4℃保存。将PCR产物经过琼脂糖胶在电压为110V下电泳35min后，用GeLDocTMXR紫外凝胶成像系统观察成像并拍照。实施例2对于PEDV和TGEV的二重PT-PCR检测方法，包括以下步骤：步骤(1)：根据PEDVE基因序列设计PEDV引物序列如下：PEDV的引物序列为序列1：ATGCTACAATTAGTGAATG，SEQIDNO:1；序列2：TTATACGTCAATAACAGTAC，SEQIDNO:2；根据TGEVN基因设计TGEV引物序列如下：TGEV的引物序列为序列3：TAGACAAACTCGCTATCGCA，SEQIDNO:3；序列4:TTCTATCTGGTCGCCATCTT，SEQIDNO:4；步骤(2)：采用RNA小量制备试剂盒，从猪肠道组织中提取总RNA；步骤(3)：将步骤(2)中提取的总RNA反转录为cDNA，以cDNA为模板进行PCR反应，获得PCR产物；PCR反应程序为94℃预变性3min；94℃变性30s；50.1℃退火30s；72℃延伸1min；共35个循环；最后72℃延伸7min；在4℃保存。将PCR产物经过琼脂糖胶在电压为110V下电泳35min后，用GeLDocTMXR紫外凝胶成像系统观察成像并拍照。实施例3对于PEDV和TGEV的二重RT-PCR检测方法，包括以下步骤：步骤(1)：根据PEDVE基因序列设计PEDV引物序列如下：PEDV的引物序列为序列1：ATGCTACAATTAGTGAATG，SEQIDNO:1；序列2：TTATACGTCAATAACAGTAC，SE本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种PEDV和TGEV的二重RT‑PCR检测的引物序列，其特征在于，所述PEDV的引物序列为序列1：ATGCTACAATTAGTGAATG，SEQ ID NO:1；序列2：TTATACGTCAATAACAGTAC，SEQ ID NO:2；所述TGEV的引物序列为序列3：TAGACAAACTCGCTATCGCA，SEQ ID NO:3；序列4:TTCTATCTGGTCGCCATCTT，SEQ ID NO:4。
【技术特征摘要】
1.一种PEDV和TGEV的二重RT-PCR检测的引物序列，其特征在于，所述PEDV的引物序列为序列1：ATGCTACAATTAGTGAATG，SEQIDNO:1；序列2：TTATACGTCAATAACAGTAC，SEQIDNO:2；所述TGEV的引物序列为序列3：TAGACAAACTCGCTATCGCA，SEQIDNO:3；序列4:TTCTATCTGGTCGCCATCTT，SEQIDNO:4。2.根据权利要求1所述PEDV和TGEV的二重RT-PCR检测的引物序列，其特征在于，所述的PEDV及TGEV的引物序列根据PEDVE基因序列及TGEVN基因设计获得。3.一种对于PEDV和TGEV的二重RT-PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤(1)：从猪肠道组织样品中提取总RNA；步骤(2)：将步骤(2)中提取的总RNA反转录为cDNA，以cDNA为模板并采用权利要求1-2中任一项获得的引物序列进行PCR反应，获得PCR产物；将PCR产物经过琼脂糖胶电泳后，用GeLDocTMXR紫外凝胶成像系统观察成像并拍照...
【专利技术属性】
技术研发人员：董波，杨小燕，戴爱玲，李晓华，
申请(专利权)人：龙岩学院，
类型：发明
国别省市：福建,35
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