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原发性胆汁性肝硬化的诊断试剂盒及相关基因在制备该试剂盒中的应用制造技术

技术编号:18955224 阅读:8 留言:0更新日期:2018-09-15 14:29
本发明专利技术提供了一种用于诊断原发性胆汁性肝硬化的基因标志物及其试剂盒,利用所述基因标志物可以快速、有效的诊断原发性胆汁性肝硬化。

【技术实现步骤摘要】
原发性胆汁性肝硬化的诊断试剂盒及相关基因在制备该试剂盒中的应用
本专利技术属于疾病研究领域,具体涉及原发性胆汁性肝硬化(PBC)的诊断标志物及其试剂盒的开发。
技术介绍
原发性胆汁性肝硬化(PBC)又名原发性胆汁胆管炎,是一种慢性肝内胆汁淤积性疾病。患者肝内汇管区大量CD4+和CD8+为主自身反应性淋巴细胞浸润,导致非化脓性胆管炎,伴随外周血清中出现高滴度抗线粒体抗体(AMA)、胆汁淤积相关的生化指标升高,并有外周血淋巴细胞亚群和多种细胞因子的变化,因而免疫系统异常在PBC发病中具有重要作用,但其机制尚不完全清楚。我国报道的PBC病例数呈不断上升趋势,但尚缺乏系统的流行病学调查。上海、广州及贵州学者在当地健康体检人群中通过筛查AMA的M2亚型(AMA—M2)及进一步检查,推算出PBC在人群中的患病率为49.2/10万~99.78/10万。这些报道提示,我国PBC的患病率并不低于国外,需要引起重视。PBC的发病机制尚不完全清楚。目前认为遗传背景和环境因素相互作用导致了免疫耐受丧失,从而启动了针对肝内胆管上皮细胞的自身免疫反应。PBC的遗传易感性研究在欧洲及北美地区显示出较高的一致性,而在亚洲包括日本和中国进行的研究一致性不高。这说明PBC的发病可能存在种族差异,也可能与地域环境因素的不同有关,提示需进一步探讨遗传与环境因素相互作用在本病发生发展中的意义。近,我国学者对南方(主要是上海和江苏)汉族PBC患者进行了研究,发现早前欧美及日本报道的14个与PBC相关的单核苷酸多态性位点中,有7个与中国PBC患者相关。这些资料提示,我国PBC患者的遗传易感性与欧美及日本既存在共性,也存在差异。早期诊断和治疗是控制PBC疾病发展的最有效手段。目前对PBC的治疗缺少有效的办法,熊去氧胆酸是唯一对早期PBC患者(尤其是黄疸没有出现的患者)进行有效控制的药物,但无治愈作用,而挽救晚期PBC患者的唯一手段是实施肝脏移植。我国是病毒性肝炎高发的国家,PBC的临床症状与病毒性肝炎相似,PBC患者早期常被误诊为病毒性肝炎或药物性肝炎,严重影响了PBC患者的诊疗。因此,对PBC患者进行早期的有效诊断,具有重要的社会意义。我们利用高通量转录组测序筛选与PBC密切相关的基因,不仅有利于研究PBC的发生和发展的病理机制,而且能为诊断和治疗PBC提供新的诊断标志物或新的药物靶点。
技术实现思路
为了弥补现有技术的不足,本专利技术的目的在于提供一种可用于PBC疾病诊疗的标志物基因。相比传统的PBC疾病的诊断和治疗方法,使用基因标志物来诊断和治疗PBC疾病具有及时性、特异性和无创性。为了实现上述目的,本专利技术采用如下技术方案:提供一种诊断原发性胆汁性肝硬化的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包含通过检测受试者外周血中PELI2基因、ZNF264基因和CDK15基因的表达水平来判断受试者是否患有原发性胆汁性肝硬化的试剂。优选地,所述试剂包括用RT-PCR、实时定量PCR或基因芯片诊断原发性胆汁性肝硬化的试剂。所述用于RT-PCR或实时定量PCR的试剂为如下引物:PELI2:正向引物为5’-CACTGCGCCCCCAATAAGG-3’(SEQIDNO:1);反向引物为5’-GTTCTCCAGAGGAGAGTGGC-3’(SEQIDNO:2);ZNF264:正向引物为5’-AGTCATGGTTCTCTGGTGGTTT-3’(SEQIDNO:3);反向引物为5’-GAAGCCCTCCTGTAGCTGTC-3’(SEQIDNO:4);CDK15:正向引物为5’-TGGGGGAAAGGTTCAAGTGC-3’(SEQIDNO:5);反向引物为5’-CACTGTTACTCCGTGGCCTT-3’(SEQIDNO:6)。所述试剂盒还包含内参基因的扩增引物:β-actin:正向引物为5’-ATCCTGCGTCTGGACCT-3’(SEQIDNO:9);β-actin:反向引物为5’-ACTTGCGCTCAGGAGGAG-3’(SEQIDNO:10)。本专利技术还涉及一种用于检测PELI2基因、ZNF264基因和CDK15基因的试剂在制备用于诊断原发性胆汁性肝硬化的试剂盒中的应用。所述试剂包括用RT-PCR、实时定量PCR或基因芯片检测所述基因的试剂。所述用于RT-PCR或实时定量PCR的试剂为SEQIDNO1-6所示的引物。本专利技术通过高通量测序筛选获得了在原发性胆汁性肝硬化中的表达显著上调或下调的基因,通过对这些基因进行进一步的筛选和验证,从中确定了3个能够用于诊断或预测个体是否患有PBC的基因标志物组合,这一组合的获得为PBC的诊断带来了极大的便利,有利于PBC的早期诊断、早期治疗。附图说明图1为提取的总RNA的电泳图。图2为PCR验证候选基因在原发性胆汁性肝硬化患者中的表达改变情况。具体实施方式下面结合附图对本专利技术做进一步的详细说明,以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。实施例1:筛选与原发性胆汁性肝硬化相关的基因1、样品收集收集医院风湿免疫科门诊或者住院部PBC患者30例,健康对照组(healthcontrol,HC)选取与PBC组年龄、性别匹配的健康志愿者30例。全部30例健康对照年龄和性别与PBC组匹配,无既往肝病史、自身免疫性疾病史、肿瘤病史及相应家族史。2、RNA样品的制备及质量分析2.1RNA样品的制备(1)PBC患者和健康志愿者,每人采集外周静脉血10ml,EDTA抗凝。(2)抽提外周血单个核细胞(PBMC):Ficoll密度梯度离心法分离PBMC。(3)分离PBMC的总RNA:Trizol一步法提取PBMC总RNA。2.2RNA样品的质量分析NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品,RNA-seq测序的样品要求:OD260/OD280为1.8-2.2。AgilentTechnologies2100Bioanalyzer检测RNA样品质量,观察28SrRNA和18SrRNA主带明显、无降解、RNA完整性指数合格、浓度达到要求的符合RNA-seq测序cDNA文库构建的要求,可以用于文库构建及测序。部分样品的RNA分析图像如图1所示。此类图像的RNA属于符合要求的RNA样品。3、高通量转录组测序3.1测序文库的建立用带有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA后,用片段化缓冲剂(Fragmentbuffer)将其打断成短片段,以mRNA为模板用6碱基随机引物合成第1条cDNA链,再加入缓冲液、RNaseH、dNTPs和DNApolymeraseI合成第2条cDNA链,再用QiaQuickPCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱;在做末端修复和加poly(A)并连接测序接头后,用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择,最后进行PCR扩增,建立测序文库。3.2测序测序用IlluminaHiSeq2000进行文库的测序,由深圳华大基因科技有限公司测序。3.3转录丰度评估及差异基因的获得用组装软件Trinity对转录组从头组装。首先SOAPdenovo程序将reads通过片段重叠连成更长的片段叫Contig;再将Contig连在一起得到两端不能再延长的序列Unigene,再对其做去冗余处理、进一步拼接、同源转录本聚类,得到最终的Unigene。匹配上的读段文件通过本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种诊断原发性胆汁性肝硬化的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包含通过检测受试者外周血中PELI2基因、ZNF264基因和CDK15基因的表达水平来判断受试者是否患有原发性胆汁性肝硬化的试剂。

【技术特征摘要】
1.一种诊断原发性胆汁性肝硬化的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包含通过检测受试者外周血中PELI2基因、ZNF264基因和CDK15基因的表达水平来判断受试者是否患有原发性胆汁性肝硬化的试剂。2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂包括用RT-PCR、实时定量PCR或基因芯片诊断原发性胆汁性肝硬化的试剂。3.根据权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,所述用于RT-PCR或实时定量PCR的试剂为如下引物:PELI2:正向引物为5’-CACTGCGCCCCCAATAAGG-3’(SEQIDNO:1);反向引物为5’-GTTCTCCAGAGGAGAGTGGC-3’(SEQIDNO:2);ZNF264:正向引物为5’-AGTCATGGTTCTCTGGTGGTTT-3’(SEQIDNO:3);反向引物为5’-GAAGCCCTCCTGTAGCTGTC-3’(SEQIDNO:4);CDK15:正向引物为5’-TGGGGGAAAGGTTCAAGTGC-3’(SEQIDNO:5);反向引物为5’-CACTGTTACTCCGTGGCCTT-3’(SEQIDNO:6)。4.根据权利要求1-3中任一项所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包含内参基因的扩增引物:β-actin:正向引物为5’-ATCCTGCGTCTGGACCT-3’(SEQIDNO:9);β-actin:反向引物为5’-ACTTGCGCTCAGG...

【专利技术属性】
技术研发人员:李璇
申请(专利权)人:李璇
类型:发明
国别省市:北京,11

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