一种筛选拳卷地钱SSR引物的方法技术

技术编号:18955177 阅读:59 留言:0更新日期:2018-09-15 14:28
本发明专利技术公开一种筛选拳卷地钱SSR引物的方法,利用SAM法,对野生种拳卷地钱(Marchantia convoluta)进行SSR分子标记研究。利用改良的CTAB方法提取DNA,再经酶切、连接、抑制性PCR、预扩增、SAM法、PCR筛选拳卷地钱SSR引物。SAM法扩增结果条带清晰,筛选得到阳性克隆进行测序,得到SSR引物序列。通过PCR筛选出有效扩增的拳卷地钱SSR引物。该SSR分子标记技术可作为拳卷地钱遗传多样性研究方法。

【技术实现步骤摘要】
一种筛选拳卷地钱SSR引物的方法
本专利技术属于遗传分子
,涉及中药资源开发利用及遗传多样性研究,具体涉及一种筛选拳卷地钱SSR引物的方法。
技术介绍
目前,运用分子标记对生物体进行遗传学研究已成为诞下的重点和热点,如何在众多的分子标记中选择适当方法对遗传研究的效率和成败具有决定意义。而在众多分子标记技术中,基于SSR标记特异性的扩增、良好的稳定性及重复性、能较好地反映物种的遗传结构和遗传多样性变化等特点,被视为比较理想的遗传标记方法。特别是近年在品种鉴定、地理来源鉴别研究、居群遗传研究、有效成分与遗传多样研究等当中得到应用。然而SSR标记具有种属特异性,不同物种间的SSR引物没有通用性,必须针对每个物种开发特异引物进行PCR检测。拳卷地钱经广西中医药大学生药学专家鉴定为地钱科地钱属植物拳卷地钱(MarchantiaconvolutaGaoetChang),采自广西各地。据文献报道,关于拳卷地钱生药学鉴别研究、挥发性成分分析、黄酮类化合物研究、脂溶性成分研究、抗急性肝损伤及抗乙肝病毒药理研究及ISSR-PCR扩增体系研究均见报道,但目前未见关于SSR遗传标记研究内容。本文采用改良的CTAB法提取拳卷地钱DNA,经酶切、连接、抑制性PCR、预扩增、SAM法扩增得到预期片段,通过PCR筛选出有效扩增的拳卷地钱SSR引物,为拳卷地钱分子资源生药鉴别、资源开发利用提供了技术基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种筛选拳卷地钱SSR引物的方法,以及由此方法得到拳卷地钱SSR引物,通过对拳卷地钱SSR引物筛选的研究,得到了拳卷地钱SSR引物30对,是一种研究拳卷地钱遗传多样性较好研究方法。采用改良的CTAB法提取拳卷地钱DNA,经酶切、连接、抑制性PCR、预扩增、SAM法扩增得到预期片段,通过PCR筛选出有效扩增的拳卷地钱SSR引物,为拳卷地钱分子资源生药鉴别、资源开发利用提供了技术基础。本专利技术的技术方案如下:一种筛选拳卷地钱SSR引物的方法,该方法首先提取拳卷地钱的基因组DNA,然后进行酶切和连接、抑制性PCR、再进行预扩增和SAM法扩增、PCR筛选出拳卷地钱SSR引物。作为技术方案的进一步改进,以上所述的一种筛选拳卷地钱SSR引物的方法,其特征在于:所述的提取拳卷地钱的基因组DNA为采用CTAB法从拳卷地钱叶片中提取到拳卷地钱的基因组DNA样品。紫外分光光度计测定显示用改良的CTAB法提取的拳卷地钱的基因组DNA的OD260/OD280比值,同时经1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度。作为技术方案的进一步改进,以上所述的一种筛选拳卷地钱SSR引物的方法,所述的酶切、连接为用限制性内切酶MseI和PstI对拳卷地钱的基因组DNA样品进行双酶切和连接,得到拳卷地钱DNA酶切和连接产物,拳卷地钱DNA酶切和连接产物的1%琼脂糖凝胶电泳检测,其片段大小为100-1500bp。作为技术方案的进一步改进,以上所述的一种筛选拳卷地钱SSR引物的方法,所述的预扩增为将拳卷地钱DNA酶切和连接产物进行预扩增,得到预扩增产物,所述的预扩增条件为:TakaraExTaq1U;10×ExTaqBuffer2μl;稀释好的suppressionPCR产物1μl;25mMMgC121.5μl;dNTPMix(各2.5mM)1.5μl;MseIadapterPrimer15pmol;PstIadapterprimer5pmol;ddH20至20μl;其中:MseIadapterprimer1的序列:5'-GACGACCGACGAGTAAC-'3PstIadapterprimer的序列:5'-AGACTGCGTACATGCAGGA-'3。作为技术方案的进一步改进,以上所述的一种筛选拳卷地钱SSR引物的方法,所述的SAM法扩增是将预扩增产物在反应体系为:10×ExTaqBuffer2μl;稀释好的预扩增产物2μl;TakaraExTaqlU;25mMMgCl21.5μl;dNTPMix(各2.5mM)1.5μl;MseIadapterprimer3(4~10)5pmol;SSRprimer(PCT6)20pmol;加ddH20至20μl,的条件下进行SAM扩增,得到SAM扩增产物。作为技术方案的进一步改进,以上所述的一种筛选拳卷地钱SSR引物的方法,所述的SAM法扩增还包括SAM扩增产物的回收与克隆,所述的SAM扩增产物的回收与克隆为:通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳将SAM扩增产物分离,随机挑选200个大小不同的SAM扩增片段,枪头压碎并用双蒸水浸泡离心,进行第二次SAM扩增,扩增产物用琼脂糖凝胶电泳纯化,DNA纯化试剂盒回收,回收产物通过与PMD18-TVector的连接,转入感受态细胞,经Amp+LB平板筛选得到阳性克隆,随机从每个平板上挑选2个白色菌落,共克隆得到了100个SAM片段用于测序。作为技术方案的进一步改进,以上所述的一种筛选拳卷地钱SSR引物的方法,所述的PCR筛选为:根据测序得到的DNA片段中所含的SSR的侧翼序列采用Primerpremier5.0软件设计特异引物,从86个片段中根据SSR位点的一侧或两侧序列设计特异引物进行合成,然后与5′锚定兼并引物SSRprimer(PCT6)组成引物对,以拳卷地钱的基因组DNA为模板,经2%的琼脂糖凝胶电泳检测,筛选出30对清晰条带的特异引物,即为拳卷地钱SSR引物。作为技术方案的进一步改进,以上所述的一种筛选拳卷地钱SSR引物的方法,所述的PCR筛选为:所述的取到拳卷地钱的基因组DNA样品后,还包括用紫外分光光度计测定显示用拳卷地钱的基因组DNA的OD260/OD280比值,同时经1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度本专利技术的有益效果为:1.本专利技术首次利用SAM法设计了拳卷地钱的SSR引物;2.本专利技术利用改良的CTAB法提取拳卷地钱DNA;3.本专利技术经酶切、连接、抑制性PCR、预扩增、SAM法扩增得到预期片段,连接扩增产物转化大肠杆菌,随机挑取白斑,筛选得到100个阳性克隆进行测序,得到SSR引物的86条序列。通过PCR筛选出有效扩增的拳卷地钱SSR引物30对;4.本专利技术涉及的SSR分子标记将应用于拳卷地钱的品种鉴定,遗传分析,遗传图谱建立,分类研究和种质资源鉴定等各个领域。附图说明图1SAM扩增产物电泳图图2引物电泳图具体实施方式1试验方法及步骤:(1)提取与纯化拳卷地钱基因组DNA吸取800μlCTAB抽提液于2ml离心管,60℃水浴预热;加入0.1g拳卷地钱叶片,200μlCTAB抽提液充分研磨后转入步骤(1)离心管中;60℃孵育2小时,15min摇匀一次;室温8000rpm,离心6min,吸取上清液转入2ml离心管;加入等体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),充分混合;8000rpm,离心10min,回收水相;加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1),再抽提一次;吸水相,加1/10倍体积NaAC(5.2M),2.5倍冰冻无水乙醇,混匀后8000rpm,离心5min;收集沉淀,75%的乙醇洗涤3遍,风干;沉淀物用去离子水溶解;加入RNAase液3μl,35℃水浴20min;水浴后,加入等体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:l)再次抽提;10000rpm离心5min,吸水本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种筛选拳卷地钱SSR引物的方法,其特征在于:该方法首先提取拳卷地钱的基因组DNA,然后进行酶切和连接、再进行预扩增和SAM法扩增、PCR筛选出拳卷地钱SSR引物。

【技术特征摘要】
1.一种筛选拳卷地钱SSR引物的方法,其特征在于:该方法首先提取拳卷地钱的基因组DNA,然后进行酶切和连接、再进行预扩增和SAM法扩增、PCR筛选出拳卷地钱SSR引物。2.根据权利要求1所述的一种筛选拳卷地钱SSR引物的方法,其特征在于:所述的提取拳卷地钱的基因组DNA为采用CTAB法从拳卷地钱叶片中提取到拳卷地钱的基因组DNA样品。3.根据权利要求2所述的一种筛选拳卷地钱SSR引物的方法,其特征在于:所述的酶切、连接为用限制性内切酶MseI和PstI对拳卷地钱的基因组DNA样品进行双酶切和连接,得到拳卷地钱DNA酶切和连接产物,拳卷地钱DNA酶切和连接产物的1%琼脂糖凝胶电泳检测,其片段大小为100-1500bp。4.根据权利要求3所述的一种筛选拳卷地钱SSR引物的方法,其特征在于:所述的预扩增为将拳卷地钱DNA酶切和连接产物进行预扩增,得到预扩增产物,所述的预扩增条件为:TakaraExTaq1U;10×ExTaqBuffer2μl;稀释好的suppressionPCR产物1μl;25mMMgC121.5μl;dNTPMix(各2.5mM)1.5μl;MseIadapterPrimer15pmol;PstIadapterprimer5pmol;ddH20至20μl;其中:MseIadapterprimer1的序列:5'-GACGACCGACGAGTAAC-'3PstIadapterprimer的序列:5'-AGACTGCGTACATGCAGGA-'3。5.根据权利要求4所述的一种筛选拳卷地钱SSR引物的方法,其特征在于:所述的SAM法扩增是将预扩增产物在反应体系为:10×ExTaqBuffer2μl;稀释好的预扩增产物2μl;TakaraExT...

【专利技术属性】
技术研发人员:朱华谢凤凤黎理周雨晴王跃峰杜沛霖
申请(专利权)人:广西中医药大学
类型:发明
国别省市:广西,45

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