内源性超支化聚精胺阳离子基因载体及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种内源性超支化聚精胺阳离子基因载体及其制备方法与应用。该基因载体的制备方法包括如下步骤：(1)将内源性单体溶于有机溶剂中，在无水无氧条件下加入保护剂，在20～30℃条件下搅拌反应，得到被保护的内源性单体I；(2)将内源性单体I溶于水中，再加入可生物降解连接剂，在60～80℃条件下进行加成反应，再加入乙醚使产物沉淀，得到聚合物II；(3)向聚合物II中加入脱保护剂进行反应，过滤，冷冻干燥，得到内源性超支化聚精胺阳离子基因载体。本发明专利技术中获得的基因载体兼具可生物降解和无毒性代谢，能够凝聚、输送核酸药物，将其与核酸药物复合，可获得用于治疗DME的纳米复合粒子，实现安全高效的基因治疗。

【技术实现步骤摘要】
内源性超支化聚精胺阳离子基因载体及其制备方法与应用
本专利技术属于生物医学工程材料领域，特别涉及一种内源性超支化聚精胺阳离子基因载体及其制备方法与应用。
技术介绍
在糖尿病的所有并发症中，糖尿病视网膜病变平均患病率高达50％。当糖尿病影响视网膜后即并发糖尿病性视网膜病，其中糖尿病性黄斑水肿(diabeticmacularedema，DME)则是糖尿病患者视力下降的首要原因，病程晚期可因牵引性视网膜全脱离导致患者完全失明。基因治疗成为目前较具潜力的DME的治疗对策，尤其是核糖核酸干扰技术，不但为研究生物体的基因表达和调控等功能提供了新方法，同时也为DME的研究、预防与治疗开辟了新途径。在基因治疗方面，RNAi(RNA干扰)是沉默特定基因的强有力工具，被广泛应用于各个研究领域。在DME的治疗研究方面，以VEGF(血管内皮生长因子)及其受体VEGFR为靶基因，对体外合成的siRNA或dsRNA进行导入，结果显示相应的siRNA可明显降低VEGF或VEGFR的表达，有效减轻VEGF对DME形成的诱导作用，抑制眼部DME形成，从而治疗DME。相比较传统的药物治疗模式，基因治疗具有不可比拟的优势：(1)通过基因递送技术可以利用载体的特性定向转染靶细胞；(2)基因治疗表达的产物均为内源性蛋白，其安全性和机体的耐受性相对外源性药物要好；(3)可在局部长时间稳定的表达抗血管生成目的因子，避免了反复局部注射可能导致的并发症[1-4]。基因治疗的关键技术之一是选择安全高效的基因载体。基因载体分病毒载体和非病毒载体两大类。病毒类基因载体是将病毒中的致病基因以治疗基因替代，由于控制病毒进入细胞、胞内运输以及编码进入细胞核部分的基因还在病毒载体上，所以病毒载体的优点是靶基因表达效率高，但同时也有免疫原性、可能激活原癌基因引发肿瘤及难以大量制备等缺点，从而限制了病毒载体的临床应用。非病毒基因载体的优势在于免疫原性弱，制备方便，对基因材料的要求限制少。目前非病毒基因递送载体多使用脂质体、聚乙烯亚胺(PEI)、树枝状聚酰胺—胺(PAMAM)等，普遍存在载体毒性大、难降解或降解产物毒性大等缺点。制备一类安全高效且可降解代谢的基因递送载体，是基因治疗领域亟待解决的重要课题[5-7]。超支化聚合物是一类高度支化的具有三维球状或类球状结构的大分子，这类大分子具有许多独特的优点：分子链间无缠结、良好的溶解性能、内部空腔大、大量活性反应基团[8]。基于超支化聚合物的结构优点，将其应用于基因载体领域有突出优越性：超支化聚合物阳离子在表面及内部均含有大量的各级胺，加上其三维的立体结构和良好的分子韧性使得其作为基因载体可以与DNA或siRNA形成结构紧密的球形，转染效率大大提高。如近期报道的树枝状聚赖氨酸改性两亲性的超支化聚缩水甘油醚衍生物用于药物和基因共传递治疗肿瘤的研究[9]和氧化还原响应性超支化聚酰胺胺衍生物用于肿瘤的基因治疗研究等，均取得了良好治疗效果，但从目前报道来看，超支化聚阳离子载体所选合成单体多为人体外源分子，其安全性和细胞毒性都需进一步改善，并且其降解产物的安全性还有待长期考察。精胺是人体精子内专职凝聚基因的多氨基分子；近年来，以精胺作为骨架构建单元的线性聚精胺阳离子载体(精胺作为骨架的聚氨基酸酯[10]、聚(二硫胺)[11]、SPE-alt-PEG聚精胺[12])都显示出了高于PEI数个数量级的基因转染活性和低于PEI十几个数量级的细胞毒性[13]。如何得到具有生物相容性好，可生物降解以及无毒性代谢的超支化基因载体已成为当前生物医学工程材料领域亟待解决的重要课题。迄今为止，将超支化结构与内源性单体相结合，构建内源性超支化阳离子基因载体及其应用尚未报道。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种内源性超支化聚精胺阳离子基因载体的制备方法。本专利技术的另一目的在于提供所述方法制备得到的内源性超支化聚精胺阳离子基因载体。本专利技术的再一目的在于提供所述内源性超支化聚精胺阳离子基因载体的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种内源性超支化聚精胺阳离子基因载体的制备方法，包括如下步骤：(1)将内源性单体溶于有机溶剂中，在无水无氧条件下加入保护剂，然后在20～30℃条件下搅拌反应，得到被保护的内源性单体I；(2)将步骤(1)中得到的内源性单体I溶于水中，再加入可生物降解连接剂，在60～80℃条件下进行加成反应，待反应结束后加入乙醚使产物沉淀，得到聚合物II；(3)向步骤(2)得到的聚合物II中加入脱保护剂，然后在30～50℃条件下搅拌反应，待反应结束后过滤，冷冻干燥，得到内源性超支化聚精胺阳离子基因载体。步骤(1)中所述的内源性单体为精胺、亚精胺和精氨酸中的至少一种。步骤(1)中所述的有机溶剂为氯仿；优选为无水氯仿。步骤(1)中所述的保护剂为三氟乙酸和2-乙酰-5，5-二甲基-1，3-环己胺二酮中的至少一种。步骤(1)中所述的内源性单体与保护剂的摩尔比为1:2～4。步骤(1)中所述的搅拌反应的条件为：300～700rpm搅拌24～36h；优选为：在25℃条件下、500～600rpm搅拌24h。步骤(2)中所述的可生物降解连接剂为含酯键的三羟甲基丙烷三丙烯酸酯和三羟乙基丁烷三丙烯酸酯中的至少一种。步骤(2)中所述的内源性单体I与可生物降解连接剂的摩尔比为3～5:1。步骤(2)中所述的加成反应的条件为：400～700rpm搅拌5～7d(天)；优选为：500～600rpm搅拌6～6.5d(天)。步骤(2)中所述的加成反应的温度优选为65℃。步骤(3)中所述的脱保护剂为三乙胺、氨水、咪唑、N-甲基吡咯烷酮和DMF(N,N-二甲基甲酰胺)中的至少一种；优选为咪唑、N-甲基吡咯烷酮和DMF混合得到的脱保护液。所述的咪唑的用量优选为按每克(g)咪唑配比5ml脱保护液计算。所述的N-甲基吡咯烷酮和DMF的体积比优选为4:1。步骤(3)中所述的脱保护剂的用量优选为按每毫升(ml)脱保护剂配比0.6mg聚合物II计算。步骤(3)中所述的搅拌反应的条件为：300～700rpm搅拌4～6h；优选为：500～600rpm搅拌4～5h。步骤(3)中所述的搅拌反应的温度优选为40℃。步骤(3)中所述的过滤为采用截留分子量为30000～60000的超滤管进行过滤，其离心速率为4000～6000rpm；优选为采用截留分子量为40000～60000的超滤管进行过滤，其离心速率为4000～5000rpm；一种内源性超支化聚精胺阳离子基因载体，通过上述任一项所述的方法制备得到。所述的内源性超支化聚精胺阳离子基因载体在制备用于治疗DME(糖尿病性黄斑水肿)的纳米复合粒子中的应用。一种用于治疗DME的纳米复合粒子，为将上述内源性超支化聚精胺阳离子基因载体与核酸药物混合均匀后，于室温下孵育20～30分钟获得。所述的核酸药物为DNA疫苗、DNA、siRNA和microRNA中的至少一种。所述的内源性超支化聚精胺阳离子基因载体与核酸药物的质量比为1:1～30。所述的用于治疗DME的纳米复合粒子(内源性超支化阳离子与核酸药物复合物)的粒径为100～300纳米。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：(1)本专利技术以内源性单体为基本结构单元，先将其用保护剂保护，再与可本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种内源性超支化聚精胺阳离子基因载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将内源性单体溶于有机溶剂中，在无水无氧条件下加入保护剂，然后在20～30℃条件下搅拌反应，得到被保护的内源性单体I；(2)将步骤(1)中得到的内源性单体I溶于水中，再加入可生物降解连接剂，在60～80℃条件下进行加成反应，待反应结束后加入乙醚使产物沉淀，得到聚合物II；(3)向步骤(2)得到的聚合物II中加入脱保护剂，然后在30～50℃条件下搅拌反应，待反应结束后过滤，冷冻干燥，得到内源性超支化聚精胺阳离子基因载体。

【技术特征摘要】
1.一种内源性超支化聚精胺阳离子基因载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将内源性单体溶于有机溶剂中，在无水无氧条件下加入保护剂，然后在20～30℃条件下搅拌反应，得到被保护的内源性单体I；(2)将步骤(1)中得到的内源性单体I溶于水中，再加入可生物降解连接剂，在60～80℃条件下进行加成反应，待反应结束后加入乙醚使产物沉淀，得到聚合物II；(3)向步骤(2)得到的聚合物II中加入脱保护剂，然后在30～50℃条件下搅拌反应，待反应结束后过滤，冷冻干燥，得到内源性超支化聚精胺阳离子基因载体。2.根据权利要求1所述的内源性超支化聚精胺阳离子基因载体的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的内源性单体为精胺、亚精胺和精氨酸中的至少一种。3.根据权利要求1所述的内源性超支化聚精胺阳离子基因载体的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的保护剂为三氟乙酸和2-乙酰-5，5-二甲基-1，3-环己胺二酮中的至少一种；步骤(2)中所述的可生物降解连接剂为三羟甲基丙烷三丙烯酸酯和三羟乙基丁烷三丙烯酸酯中的至少一种；步骤(3)中所述的脱保护剂为三乙胺、氨水、咪唑、N-甲基吡咯烷酮和DMF中的至少一种。4.根据权利要求1所述的内源性超支化聚精胺阳离子基因载体的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的内源性单体与保护剂的摩尔比为1:2～4；步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛巍，纪鑫，马栋，郭会龙，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东,44