缺刻缘绿藻溶血磷脂酸酰基转移酶基因及其应用制造技术

本发明专利技术涉及缺刻缘绿藻溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)基因及其应用。本发明专利技术克隆了缺刻缘绿藻LPAAT这个被认为是TAG合成的关键酶的基因，并命名为MiLPAAT。进一步构建了MiLPAAT的原核表达载体，经转化大肠杆菌BL21并诱导培养后，纯化获得重组表达的MiLPAAT成熟蛋白，体外酶活性检测和酶催化反应产物的薄层色谱结果显示，重组的MiLPAAT成熟蛋白可以将LPA合成为PA，表明MiLPAAT编码的蛋白具有LPAAT的功能，能将LPA催化合成为PA，后者沿着肯尼迪途径，在藻细胞中可进一步被合成为TAG。本发明专利技术为利用MiLPAAT基因在粮油作物中过表达以增加三酰甘油的产量奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
缺刻缘绿藻溶血磷脂酸酰基转移酶基因及其应用
本专利技术涉及生物能源和植物生物
，具体地说，涉及一种缺刻缘绿藻溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)的基因及其应用。
技术介绍
目前，各种矿产资源如煤、石油、天然气等，随着不断的开发和利用而逐渐耗尽，人类急需寻找新的能源，特别是可再生能源。科学家认为生物乙醇和生物柴油是两个重要的液体生物燃料，并且有可能通过大规模生产生物质来替代石油类燃料。生物柴油由于其具有来源比较广泛、可以降解、热值高及对环境比较友好等优点，已经成为世界各国开发新能源的一个热点。其中，微藻因含油量高、其养殖可不占用耕地并能与废水处理相结合等特点，利用微藻制备生物柴油也成为科学家越来越关注的焦点。不同种类微藻合成三酰甘油(triacylglycerol，TAG)的能力不同。研究发现，绿藻、硅藻等真核微藻的油脂含量比较高，有希望成为生产生物柴油的可开发资源。缺刻缘绿藻(MyrmeciaincisaReisiglH4301)是一种淡水单细胞微藻，隶属绿藻门(Chlorophyta)。该藻能大量积累TAG，尤其是在缺氮条件下，是潜在的生产微藻生物柴油藻种。植物及微藻油脂的主要成分是甘油三脂肪酸酯，该物质又被称为三酰甘油，即TAG，它是一种中性脂，在植物及藻类的生长与发育中起着重要作用。TAG的从头合成是沿着肯尼迪(Kennedy)途径，即在内质网上经3种酰基转移酶的先后作用，脂肪酸逐步添加在甘油-3-磷酸的骨架上而形成的(Caoetal.，2006；Baraletal.，2012)。这3种酰基转移酶分别为甘油-3-磷酸酰基转移酶(glycerol-3-phosphate1-acyltransferase，GPAT)、溶血磷脂酸酰基转移酶(lysophosphatidicacidacyltransferase，LPAAT)和二酰甘油酰基转移酶(diacylglycerolO-acyltransferase，DGAT)。其中，LPAAT能将脂肪酸-CoA添加到溶血磷脂酸(lysophosphatidicacid，LPA)甘油骨架的sn-2位，从而生成磷脂酸(phosphatidicacid，PA)。其产物PA，一方面可用于沿着肯尼迪途径继续合成TAG，另一方面可用于合成膜磷脂类物质(Weselakeetal.，2009)。因而，LPAAT基因是油脂合成的关键基因。《中山大学》2010硕士论文“花生溶血磷脂酸酰基转移酶基因的克隆和功能初步研究”，根据植物溶血磷脂酸酰基转移酶保守的氨基酸序列，通过比对同源性较高的区域，设计改良的简并引物进行PCR，从花生cDNA文库中钓取出一个LPAAT基因cDNA片段，再根据获得的部分序列设计基因特异性引物，通过cDNA末端快速扩增技术(RACE)获得该cDNA的3′-和5′-末端序列，从而得到全长为1561个碱基的cDNA序列，分析表明该序列具有一个长度为1131bp，编码376个氨基酸的开放阅读框(ORF)，生物信息学分析表明该氨基酸序列具有保守的酰基转移酶结构域，将该基因的氨基酸序列进行比对分析发现其与蓖麻LPAAT(Ricinuscommunisputativelysophosphatidicacidacyltransferase,LPAAT,GenBank登录号：ACB30546.1)的氨基酸同源性为90％，和油桐(Verniciafordiiputativeglycerol-3-phosphateacyltransferase,GenBank登录号：ACT32030.1)同源相似性为90％，故将其命名为AhLPAAT(ArachishypogaeaLysophosphatidicAcidAcyltransferase)。还克隆了该基因的DNA序列(全长为3822bp)。然而，目前还未见克隆缺刻缘绿藻溶血磷脂酸酰基转移酶基因，尤其是可利用价值高的缺刻缘绿藻溶血磷脂酸酰基转移酶基因的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供缺刻缘绿藻溶血磷脂酸酰基转移酶基因及其应用。第一方面，本专利技术提供了一种多肽，所述的多肽的氨基酸序列选自下列中的任一种：a)SEQIDNO:2所示的氨基酸序列；b)SEQIDNO:2的第52-331位所示的氨基酸序列；c)SEQIDNO:3所示的氨基酸序列。第二方面，本专利技术提供了一种分离的核苷酸序列，所述的核苷酸序列编码如上所述的多肽。优选地，所述的核苷酸序列其序列含有下列中的任一种：a)SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；b)SEQIDNO:1的第140-1135位所示的核苷酸序列；c)SEQIDNO:1的第293-1135位所示的核苷酸序列；d)至少包含SEQIDNO:1的第293-1135位所示的核苷酸序列，且与SEQIDNO:1具备70％以上的同源性；e)与以上a)、b)、c)或d)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。更优选地，所述的核苷酸序列其序列至少包含SEQIDNO:1的第293-1135位所示的核苷酸序列，且与SEQIDNO:1具备80％以上的同源性。更优选地，所述的核苷酸序列其序列至少包含SEQIDNO:1的第293-1135位所示的核苷酸序列，且与SEQIDNO:1具备90％以上的同源性。更优选地，所述的核苷酸序列其序列至少包含SEQIDNO:1的第293-1135位所示的核苷酸序列，且与SEQIDNO:1具备95％以上的同源性。更优选地，所述的核苷酸序列其序列至少包含SEQIDNO:1的第293-1135位所示的核苷酸序列，且与SEQIDNO:1具备99％以上的同源性。第三方面，本专利技术提供了一种重组表达载体，所述的重组表达载体是由如上所述的核苷酸序列与质粒或病毒所构建的重组表达载体。第四方面，本专利技术提供了一种基因工程化的宿主细胞，所述的宿主细胞选自于下列中的一种：a)用如上所述的核苷酸序列转化或转导的宿主细胞；b)用如上所述的重组表达载体转化或转导的宿主细胞。优选地，所述的宿主细胞是细菌细胞、真菌细胞、不具备细胞全能性的植物细胞或不具备细胞全能性的动物细胞。第五方面，本专利技术提供了如上所述的多肽、如上所述的核苷酸序列、如上所述的重组表达载体、如上所述的宿主细胞在增加油脂产量中的用途。优选地，所述的增加油脂产量指增加磷脂酸产量或三酰甘油产量。本专利技术优点在于：缺刻缘绿藻富含花生四烯酸(arachidonicacid，ArA，20:4Δ5,8,11,14)，且其TAG中2/3的脂肪酸为ArA(欧阳珑玲等，2016)。为了解析ArA如何以储藏脂的形式存在于藻细胞中，基于微藻TAG从头合成的肯尼迪途径，本专利技术基于专利技术人丰富的研究经验，尤其是生物信息学分析经验，利用cDNA末端快速扩增(rapidamplificationofcDNAends，RACE)技术克隆了缺刻缘绿藻LPAAT这个被认为是TAG合成的关键酶的基因。该基因的cDNA全长序列长为1375bp，开放阅读框(ORF)序列长为996bp，编码331个氨基酸残基；3’-非翻译区(UTR)序列长为240bp，5’-UTR序列长为139bp。它具有酰基转移酶结构域PlsC，与Auxenochlorellaprotothecoides的LPAAT(G本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多肽，其特征在于，所述的多肽的氨基酸序列选自下列中的任一种：a)SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；b)SEQ ID NO:2的第52‑331位所示的氨基酸序列；c)SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种多肽，其特征在于，所述的多肽的氨基酸序列选自下列中的任一种：a)SEQIDNO:2所示的氨基酸序列；b)SEQIDNO:2的第52-331位所示的氨基酸序列；c)SEQIDNO:3所示的氨基酸序列。2.一种分离的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列编码权利要求1所述的多肽。3.根据权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列其序列含有下列中的任一种：a)SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；b)SEQIDNO:1的第140-1135位所示的核苷酸序列；c)SEQIDNO:1的第293-1135位所示的核苷酸序列；d)至少包含SEQIDNO:1的第293-1135位所示的核苷酸序列，且与SEQIDNO:1具备70％以上的同源性；e)与以上a)、b)、c)或d)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。4.根据权利要求3所述的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列其序列至少包含SEQIDNO:1的第293-1135位所示的核苷酸序列，且与SEQIDNO:1具...

【专利技术属性】
技术研发人员：周志刚，常依娜，包虹，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：上海,31