功能化氨基酸、制备方法及由其制得的功能化氨基酸水凝胶技术

本发明专利技术涉及功能化氨基酸、制备方法及由其制得的功能化氨基酸水凝胶。制备方法包括如下步骤：S1、合成聚氨基酸aPEG‑PELG13；S2、合成功能化聚氨基酸aPEG‑PELG‑KGN。本发明专利技术提供的制备方法可将KGN这一小分子化合连接到聚氨基酸上，制得修饰有KGN的功能化聚氨基酸。采用上述聚氨基酸可以在33℃左右形成稳定的凝胶，因此便于在低温状态和细胞混合并用于体内注射。此外，采用本发明专利技术提供的功能化聚氨基酸所形成的凝胶具有良好的生物可降解性；对于包裹其中的间充质干细胞能够促进细胞增殖，以及向软骨细胞分化。

【技术实现步骤摘要】
功能化氨基酸、制备方法及由其制得的功能化氨基酸水凝胶
本专利技术涉及医药材料
，尤其涉及功能化氨基酸、制备方法及由其制得的功能化氨基酸水凝胶。
技术介绍
聚氨基酸因其具有规整的二级结构、良好的生物相容性和生物可降解性，在药物控制释放、组织工程、生物粘附、抗菌材料和免疫调节等领域具有广阔的应用前景。它一种优异的药物控制释放载体，通常以水凝胶的形式发挥药物控制释放载体的作用。Kartogenin(即KGN)，其分子式为C20H15NO3，是一种具有极强的促进骨分化能力的小分子化合物，能有效地促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。它可明显抑制白介素1β(interleukir1β，1L-1β)引起的细胞外质和蛋白聚糖的减少，同时对于促进软骨细胞分泌物lubricin的分泌与转化生长因子β1(transforminggrowthfactorβ1，TGF-β1)、骨形态发生蛋白7(bonemorphogenetic7，BMP-7)具有协同作用，还能促进腱骨连接处形成软骨组织。目前，还未见将KGN与聚氨基酸结合应用的相关报道。若是能够提供一种制备方法，将KGN修饰到聚氨基酸上，则可同时扩展KGN和聚氨基酸凝胶载体相关领域的应用。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
(一)要解决的技术问题针对现有技术中缺乏将KGN修饰到聚氨基酸上的制备技术，本专利技术提供了一种制备方法，利用该制备方法制得的功能化聚氨基酸连接有KGN，它可以在33℃左右形成稳定的凝胶，因此便于在低温状态和细胞混合并用于体内注射。此外，采用本专利技术提供的功能化聚氨基酸所形成的凝胶具有良好的生物可降解性；对于包裹其中的细胞能够促进细胞增殖，以及向软骨细胞分化。(二)技术方案为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种功能化聚氨基酸的制备方法，包括如下步骤：S1、合成聚氨基酸aPEG-PELG13：合成端氨基烯丙基聚乙二醇：aPEG-NH2；将aPEG-NH2作为引发剂引发γ-乙基-L-谷氨酸酯-N-羧酸酐开环聚合得到烯丙基聚乙二醇-聚(γ-乙基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物，即聚氨基酸aPEG-PELG13；S2、合成功能化聚氨基酸aPEG-PELG-KGN：将aPEG-PELG13和Kartogenin分别溶于N,N-二甲基甲酰胺中，配制得到聚氨基酸溶液和KGN溶液，将KGN溶液经EDC/NHS活化，然后在冰水浴中滴加到聚氨基酸溶液中，并进行搅拌，在聚氨基酸一端修饰上KGN，得到功能化聚氨基酸aPEG-PELG-KGN。优选地，本专利技术提供的制备方法还包括S3：合成功能化聚氨基酸RGD-PEG-PELG-KGN，所述S3包括如下步骤：将aPEG-PELG-KGN、CRGD肽、偶氮二异丁腈溶于N,N-二甲基甲酰胺中，除氧后，在氮气保护下加热进行反应，aPEG-PELG-KGN的烯丙氧基参与反应，在aPEG-PELG-KGN的一端修饰上RGD，得到功能化聚氨基酸RGD-PEG-PELG-KGN。优选地，在S2中，所述aPEG-PELG13和所述KGN的用量比为(4.3～5)：1，优选为(4.54～4.55)：1。进一步优选地，S2中还包含纯化步骤，此时所述S2按照如下方式进行：将2.5～3.0gaPEG-PELG13溶于25～30mLN,N-二甲基甲酰胺中，配制成聚氨基酸溶液，将0.55～0.60gKartogenin溶于15～20mLN,N-二甲基甲酰胺中，配制成KGN溶液；将KGN溶液经EDC/NHS活化，然后在冰水浴中滴加到聚氨基酸溶液中，搅拌3～4天后，用截留量为3000的透析袋在水中透析3天，每6小时换一次水，得到aPEG-PELG-KGN。优选地，所述EDC/NHS活化中，EDC和NHS的用量比为(1.6～1.7)：1.2。优选地，在S3中，所述aPEG-PELG-KGN、CRGD肽、偶氮二异丁腈的用量比为(79～82)：(58～62)：(3～4)，优选为80:60:3。优选地，S3中还包含纯化步骤，此时所述S3按照如下方式进行:将2.0～2.5gaPEG-PELG-KGN、1.5～1.6gCRGD肽和75～80mg偶氮二异丁腈溶于N,N-二甲基甲酰胺中，放入安全瓶中在液氮条件下冷冻后用高压油泵抽至少20min，充入氮气保护，融化后再抽至少20min，重复3次以除去其中的氧气，然后氮气保护下加热至65～70℃并进行搅拌，反应3～4天后，将产物依次进行沉降、抽滤、透析，得到RGD-PEG-PELG-KGN；优选地，所述透析采用截留量为3000的透析袋进行，透析时间为3～4天。优选地，所述S1按照如下方式进行：10～15gaPEG-NH2和1000mL干燥的甲苯在130℃下共沸除去aPEG-NH2中的水分，然后抽干甲苯，加入15～22.5gγ-乙基-L-谷氨酸酯-N-羧酸酐和150mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺，氮气保护下在25℃反应5～6天，产物经沉降、干燥得到aPEG-PELG13。优选地，所述合成aPEG-NH2的步骤包括：将分子量为2000的aPEG、甲苯磺酰氯和氢氧化钾混合，加入二氯甲烷后在室温下搅拌反应，然后用饱和食盐水洗涤，将下层有机相依次进行干燥、过滤、沉降、抽滤，得白色粉末固体；将白色粉末固体、氯化铵和氨水溶解，室温下搅拌反应5天，将产物依次进行萃取、饱和食盐水洗涤、干燥、沉降，得到aPEG-NH2；优选地，所述aPEG、甲苯磺酰氯和氢氧化钾的用量比为(15～20):(7～11):(1.3～1.6)，最优选为20:9.5:1.68。本专利技术还提供了一种功能化聚氨基酸，采用上述制备方法制备而成。本专利技术还提供了一种功能化聚氨基酸水凝胶，采用上述功能化聚氨基酸制得；优选地，所述水凝胶的质量分数为4～10％，例如，为4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％。(三)有益效果本专利技术的上述技术方案具有如下优点：本专利技术提供了一种制备方法，将KGN这一小分子化合连接到聚氨基酸上，制得功能化聚氨基酸aPEG-PELG-KGN和RGD-PEG-PELG-KGN。采用本专利技术制得的聚氨基酸可以在33℃左右形成稳定的凝胶，因此便于在低温状态和细胞混合并用于体内注射。此外，采用本专利技术提供的功能化聚氨基酸所形成的凝胶具有良好的生物可降解性；对于包裹其中的细胞能够促进细胞增殖，以及向软骨细胞分化。附图说明图1和图2分别是对实施例2制得的aPEG-PELG13和RGD-PEG-PELG-KGN两种聚氨基酸进行1HNMR测试所得的核磁谱图；图3是实施例2和对比例制得的四种聚氨基酸所形成的水凝胶的相位转变图；图4是实施例2和对比例制得的四种聚氨基酸所形成的水凝胶的流变图；图5是实施例2制得的aPEG-PELG13和RGD-PEG-PELG-KGN两种聚氨基酸的体外降解实验结果图；图6是实施例2制得的RGD-PEG-PELG-KGN所形成的凝胶在体外KGN的释放曲线；图7是CCK-8检测不同功能化凝胶中的细胞增殖结果；图8和图9分别是不同功能化凝胶中的细胞DNA和GAG含量检测结果，其中图8是DNA含量检测结果，图9是GAG含量检测结果；图10是PBMSCs在三种功能化凝胶内经体外成软骨诱导3周后的分化状态。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.功能化聚氨基酸的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、合成聚氨基酸aPEG‑PELG13：合成端氨基烯丙基聚乙二醇：aPEG‑NH2；将aPEG‑NH2作为引发剂引发γ‑乙基‑L‑谷氨酸酯‑N‑羧酸酐开环聚合得到烯丙基聚乙二醇‑聚(γ‑乙基‑L‑谷氨酸酯)嵌段共聚物，即聚氨基酸aPEG‑PELG13；S2、合成功能化聚氨基酸aPEG‑PELG‑KGN：将aPEG‑PELG13和Kartogenin分别溶于N,N‑二甲基甲酰胺中，配制得到聚氨基酸溶液和KGN溶液，将KGN溶液经EDC/NHS活化，然后在冰水浴中滴加到聚氨基酸溶液中，并进行搅拌，在聚氨基酸一端修饰上KGN，得到功能化聚氨基酸aPEG‑PELG‑KGN。

【技术特征摘要】
1.功能化聚氨基酸的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、合成聚氨基酸aPEG-PELG13：合成端氨基烯丙基聚乙二醇：aPEG-NH2；将aPEG-NH2作为引发剂引发γ-乙基-L-谷氨酸酯-N-羧酸酐开环聚合得到烯丙基聚乙二醇-聚(γ-乙基-L-谷氨酸酯)嵌段共聚物，即聚氨基酸aPEG-PELG13；S2、合成功能化聚氨基酸aPEG-PELG-KGN：将aPEG-PELG13和Kartogenin分别溶于N,N-二甲基甲酰胺中，配制得到聚氨基酸溶液和KGN溶液，将KGN溶液经EDC/NHS活化，然后在冰水浴中滴加到聚氨基酸溶液中，并进行搅拌，在聚氨基酸一端修饰上KGN，得到功能化聚氨基酸aPEG-PELG-KGN。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，还包括S3：合成功能化聚氨基酸RGD-PEG-PELG-KGN，所述S3包括如下步骤：将aPEG-PELG-KGN、CRGD肽、偶氮二异丁腈溶于N,N-二甲基甲酰胺中，除氧后，在氮气保护下加热进行反应，aPEG-PELG-KGN的烯丙氧基参与反应，在aPEG-PELG-KGN的一端修饰上RGD，得到功能化聚氨基酸RGD-PEG-PELG-KGN。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在S2中，所述aPEG-PELG13和所述KGN的用量比为(4.3～5)：1，优选为(4.54～4.55)：1。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，S2中还包含纯化步骤，此时所述S2按照如下方式进行：将2.5～3.0gaPEG-PELG13溶于25～30mLN,N-二甲基甲酰胺中，配制成聚氨基酸溶液，将0.55～0.60gKartogenin溶于15～20mLN,N-二甲基甲酰胺中，配制成KGN溶液；将KGN溶液经EDC/NHS活化，然后在冰水浴中滴加到聚氨基酸溶液中，搅拌3～4天后，用截留量为3000的透析袋在水中透析3天，每6小时换一次水，得到aPEG-PELG-KGN；优选地，所述EDC/NHS活化中，EDC和NHS的用量比为(1.6～1.7)：1.2。5.根据权利要求2所述的制备方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：余家阔，王少杰，丁建勋，
申请(专利权)人：北京大学第三医院，中国科学院长春应用化学研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11