一种化学发光间接竞争免疫检测铜离子的试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种化学发光间接竞争免疫检测铜离子的试剂盒及其应用，属于重金属免疫检测技术领域。所述试剂盒包括以下组分：酶标板、铜离子检测完全抗原、铜离子单克隆抗体、酶标二抗、发光底物、封闭液和洗涤液；所述试剂盒的使用方法：1)将铜离子检测完全抗原包被于酶标板上，封闭、洗涤；2)加入待检样品和铜离子单克隆抗体进行一抗孵育、第一洗涤后，加入酶标二抗，进行酶标二抗孵育、第二洗涤；3)加入发光底物反应、静置后，读取发光信号值B；4)将所述发光信号值B带入标准曲线线性回归方程计算获得待检样品中铜离子浓度。所述试剂盒能够用于不同样品中铜离子浓度的测定，准确度和精密度高、特异性好，测定结果稳定。

A chemiluminescence indirect competitive immunoassay kit for detecting copper ions and its application

The invention provides a chemiluminescence indirect competitive immunoassay kit for detecting copper ions and its application, belonging to the technical field of heavy metal immunoassay. The kit comprises the following components: enzyme label plate, copper ion detection complete antigen, copper ion monoclonal antibody, enzyme labeled second antibody, luminous substrate, sealing solution and washing solution; the use method of the kit is: 1) the copper ion detection complete antigen is coated on the enzyme label plate, blocked and washed; 2) the sample to be tested and the copper ion is added; After anti-incubation and first washing, the monoclonal antibody was added with enzyme-labeled second antibody, incubated with enzyme-labeled second antibody, and washed with second washing; 3) After adding the reaction of luminous substrates and stationary, the luminous signal value B was read; 4) The luminous signal value B was brought into the standard curve linear regression equation to calculate the concentration of copper ion in the sample to be detected. The kit can be used for the determination of copper ion concentration in different samples with high accuracy and precision, good specificity and stable determination results.

【技术实现步骤摘要】
一种化学发光间接竞争免疫检测铜离子的试剂盒及其应用
本专利技术属于重金属免疫检测
，尤其涉及一种化学发光间接竞争免疫检测铜离子的试剂盒及其应用。
技术介绍
重金属在地球上广泛分布，正常情况下不会对人类的生活环境造成危害。但随着城市的急速扩张和工业的快速发展，大量重金属因人为活动以非常态速度进入我们的生活环境，这些重金属及其化合物多有致畸、致癌作用，并且都是蓄积性毒物，通过饮用水或食物链富集等方式严重危害人类及动物的健康。目前对于环境污染最严重的重金属包括：铅、镉、汞、铬、砷(号称“五毒”)，除此之外，还包括毒性相对较弱的镍、锌、铜、钴、锡、钒等。虽然重金属铜的毒性相对较弱，但是因其在工业、农业及畜牧业的广泛应用，铜污染的危害也越来越多的引起人们的关注。人体摄入过量的铜会引发一系列病变，急性铜中毒可引起胃肠道黏膜刺激症状，如恶心、干呕、腹泻，甚至溶血性贫血，肾功能衰竭、休克、昏迷或死亡。慢性摄入铜过高，可引起呼吸系统疾病，铜粉尘可引起咽痛、咳嗽、咯痰和胸闷气憋，甚至出现尘肺等。另外，铜盐具有一定杀菌效果，所以在饲料中也被广泛使用，但高剂量的铜进入家畜的体内很难被代谢，随着生物累积效应造成家畜中毒死亡，还会通过食用家畜肉制品而直接威胁人类健康。因此，加强食品和环境卫生的重金属铜的监查检测迫在眉睫，意义重大。传统重金属检测方法多采用物理/化学方法，如原子吸收光谱法(AAS)、原子荧光光谱法(AFS)、电感耦合等离子体光谱分析法(ICP)等，虽然其检测结果准确，可信度高，但需要大型仪器设备和专业人员操作，分析时间长，成本昂贵，有一定时间地点局限性，难以适应突发性的环境污染事件或大规模环境质量筛查检测。现有的重金属铜的检测方法成本高、效率低、准确性欠佳。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种成本低、效率高、准确率高的化学发光间接竞争免疫检测铜离子试剂盒及其应用。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：一种化学发光间接竞争免疫检测铜离子的试剂盒，包括以下组分：酶标板、铜离子检测完全抗原、铜离子单克隆抗体、酶标二抗、发光底物、封闭液和洗涤液；所述铜离子检测完全抗原包括铜离子、载体蛋白以及将所述铜离子与载体蛋白偶联的螯合剂。优选的，所述螯合剂为双功能螯合剂p-SCN-Bn-NOTA；所述载体蛋白为鸡卵白蛋白OVA。优选的，所述铜离子单克隆抗体由细胞株4F12分泌产生，所述细胞株4F12的保藏编号为CCTCCC201670。优选的，所述铜离子单克隆抗体的浓度为20～30ng/ml。优选的，所述铜离子检测完全抗原的浓度为100～200ng/ml。本专利技术还提供了所述试剂盒在检测样品铜离子浓度中的应用。优选的所述应用方法，包括以下步骤：1)将铜离子检测完全抗原包被于酶标板上，封闭液封闭、洗涤液洗涤后获得包被有铜离子检测完全抗原的酶标板；2)向所述包被铜离子检测完全抗原的酶标板中加入待检样品和铜离子单克隆抗体进行一抗孵育、第一洗涤后，加入酶标二抗，进行酶标二抗孵育、第二洗涤后获得待发光酶标板；3)向所述待发光酶标板中加入发光底物反应、静置后，读取发光信号值B；4)将所述发光信号值B带入预定的标准曲线线性回归方程计算获得待检样品中铜离子浓度；所述预定的标准曲线线性回归方程为y＝39.714x+1.2073，其中x为发光抑制率，y为待检样品中的铜离子浓度，x＝(B0-B)/B0×100％，B0为未添加待检样品是的发光信号值；所述铜离子检测完全抗原由螯合剂将铜离子与载体蛋白偶联获得；所述待检样品是由样品与螯合剂偶联获得。优选的，所述标准曲线线性回归方程通过以下方法获得：用不同梯度浓度的竞争物标准品Cu-NOTA替换步骤2)中的待检样品，按照步骤1)～3)的方法获得发光信号值B，以0ng/ml竞争物标准品的发光信号值为B0，计算不同梯度浓度竞争物标准品的发光抑制率x，x＝(B0-B)/B0×100％，以发光抑制率为纵坐标，以Cu2+浓度log10对数为横坐标，绘制标准曲线，获得标准曲线线性回归方程。优选的，所述铜离子检测完全抗原制备过程中铜离子、螯合剂和载体蛋白摩尔比为(75～80):(68～72):1。优选的，所述样品包括中草药样品、土壤样品和水样。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的试剂盒可通过化学发光间接竞争免疫检测铜离子的浓度，该试剂盒包括铜离子检测完全抗原，所述铜离子检测完全抗原将小分子的铜离子与载体蛋白偶联，使铜离子能够通过免疫的方法检测，利用发光抑制率与铜离子浓度log10对数的线性关系定量测定铜离子浓度，所述试剂盒通过化学发光间接竞争免疫检测法检测铜离子的浓度，以发光抑制率为纵坐标，以Cu2+浓度log10对数为横坐标，绘制标准曲线，检测待检样品中铜离子的浓度，能够实现铜离子浓度的快速高效检测；检测灵敏度(IC50)为16.9ng/ml，检测范围(IC20-IC80)为2.9-96.4ng/ml，检测限(IC10)为1.6ng/ml。附图说明图1为铜离子检测完全抗原的SDS-PAGE鉴定图；图2为BCA法测定铜离子检测完全抗原蛋白浓度的标准曲线；图3为实施例2中化学发光间接竞争免疫法测定铜离子浓度标准曲线。生物保藏说明铜离子单克隆抗体的细胞株4F12，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，武汉大学保藏中心；保藏时间：2016年6月8日，保藏编号为CCTCCC201670。具体实施方式本专利技术提供了一种化学发光间接竞争免疫检测铜离子的试剂盒，包括以下组分：酶标板、铜离子检测完全抗原、铜离子单克隆抗体、酶标二抗、发光底物、封闭液和洗涤液；所述铜离子检测完全抗原包括铜离子、载体蛋白以及将所述铜离子与载体蛋白偶联的螯合剂。本专利技术所述的试剂盒包括酶标板，本专利技术对所述酶标板没有特殊限定，采用本领域常规的酶标板即可，例如常规的96孔板。所述酶标板优选的为黑色酶标板，黑色有利用发光信号的检测。本专利技术所述的试剂盒包括铜离子检测完全抗原，所述铜离子检测完全抗原包括铜离子、载体蛋白以及将所述铜离子与载体蛋白偶联的螯合剂。在本专利技术中所述螯合剂优选的为双功能螯合剂p-SCN-Bn-NOTA(以下简称NOTA)；所述载体蛋白优选的为鸡卵白蛋白OVA。在本专利技术中，所述铜离子、螯合剂和载体蛋白摩尔比优选为(75～80):(68～72):1，更优选的为77:70:1。在本专利技术中，所述铜离子检测完全抗原的制备方法包括以下步骤：S1)将螯合剂溶液逐滴滴加至载体蛋白溶液中螯合获得螯合蛋白溶液；S2)将铜离子溶液逐滴滴加至所述螯合蛋白溶液中螯合至反应液呈淡蓝色，并伴有浑浊获得铜离子检测完全抗原。在本专利技术中，所述螯合剂溶液优选的为将所述NOTA粉末溶解于DMSO中获得，所述NOTA溶液的浓度优选的为25mg/ml；所述OVA蛋白溶液优选的为将OVA蛋白粉末溶解于HEPES缓冲液中获得，所述HEPES缓冲液的浓度优选的为0.1M，pH值优选的为8.9；所述OVA蛋白溶液的浓度优选的为10mg/ml；在本专利技术中，所述NOTA与OVA的摩尔比优选的为(68～72):1，更优选的为70:1；本专利技术将所述螯合剂溶液逐滴加入OVA液中，0～4℃搅拌螯合2～4h，4℃过夜获得螯合蛋白溶液。本专利技术所述的双功能本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种化学发光间接竞争免疫检测铜离子的试剂盒，其特征在于，包括以下组分：酶标板、铜离子检测完全抗原、铜离子单克隆抗体、酶标二抗、发光底物、封闭液和洗涤液；所述铜离子检测完全抗原包括铜离子、载体蛋白以及将所述铜离子与载体蛋白偶联的螯合剂。

【技术特征摘要】
1.一种化学发光间接竞争免疫检测铜离子的试剂盒，其特征在于，包括以下组分：酶标板、铜离子检测完全抗原、铜离子单克隆抗体、酶标二抗、发光底物、封闭液和洗涤液；所述铜离子检测完全抗原包括铜离子、载体蛋白以及将所述铜离子与载体蛋白偶联的螯合剂。2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述螯合剂为双功能螯合剂p-SCN-Bn-NOTA；所述载体蛋白为鸡卵白蛋白OVA。3.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，步骤2)所述铜离子单克隆抗体由细胞株4F12分泌产生，所述细胞株4F12的保藏编号为CCTCCC201670。4.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述铜离子单克隆抗体的浓度为20～30ng/ml。5.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述铜离子检测完全抗原的浓度为100～200ng/ml。6.权利要求1～5任意一项所述试剂盒在检测样品铜离子浓度中的应用。7.权利要求6所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：1)将铜离子检测完全抗原包被于酶标板上，封闭液封闭、洗涤液洗涤后获得包被有铜离子检测完全抗原的酶标板，所述铜离子检测完全抗原由螯合剂将铜离子与载体蛋白偶联获得；2)向所述包被铜离子检测完全抗原的酶标板中加入待检样品和铜离子单克隆抗体进行一抗孵育、第一洗涤后，加...

【专利技术属性】
技术研发人员：向军俭，黄建芳，杨浩，郝代玲，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东,44