一种桂枝有效成分潜在用途评价与生产过程监测方法技术

本发明专利技术为一种桂枝有效成分潜在用途评价与生产过程监测方法，前者主要内容包括运用微量热泳动技术测定桂皮醛与人血清白蛋白的相互作用，从配体亲和力的角度评价其潜在用途，为保证方法的准确性与可靠性，采用了一种经报道与人血清白蛋白有很好结合能力的阳性对照品—布洛芬和两种化合物—芍药苷和甘草酸作为对照；后者的主要内容是应用近红外光谱法对桂枝有效成分桂皮醛生产过程的实时监控为确保所建模型的准确性和稳健性，对模型的五项评价指标进行了综合评价与分析。

Potential use evaluation and production process monitoring method of an effective component of Ramulus Cinnamomi

The invention relates to a method for evaluating the potential use of active components of Cinnamomum cassia and monitoring the production process. The former mainly includes the determination of the interaction between cinnamaldehyde and human serum albumin by microcalorimetric swimming technique, and the evaluation of its potential use from the angle of ligand affinity. In order to ensure the accuracy and reliability of the method, a method is adopted. Ibuprofen and two compounds, paeoniflorin and glycyrrhizic acid, which were reported to have good binding ability to human serum albumin, were used as control. The main content of the latter was the real-time monitoring of the production process of cinnamaldehyde, an effective component of Cinnamomum cassia Branch, by near infrared spectroscopy to ensure the accuracy and robustness of the model. Comprehensive evaluation and analysis were made on the five evaluation indexes.

【技术实现步骤摘要】
一种桂枝有效成分潜在用途评价与生产过程监测方法
本专利技术属于中药领域，具体涉及一种桂枝有效成分潜在用途评价方法和其生产过程监测方法。
技术介绍
桂枝来源于樟科植物肉桂的干燥嫩枝，为临床常用中药。桂皮醛是桂枝挥发油中的主要成分，经国内外学者研究表明，其具有抗炎、解热镇痛、抗肿瘤等广泛的药理作用，对神经系统疾病、心血管疾病以及糖尿病等多个系统的疾病均具有一定的治疗作用。并且桂皮醛分子量小，结构简单，较易于获得，因此具有很好的药物开发前景。人血清白蛋白是血浆中含量最丰富的蛋白，无论与内源性还是外源性物质都有很好的结合和运输能力，许多药物进入血液都会首先与结合再被运输至靶器官或靶组织。药物与血浆蛋白结合过程中可能会伴随着小分子配体和大分子受体构象的改变，其作用位点数、结合的具体位置以及相互作用力类型和热力学参数等的不同都会在一定程度上影响它们效应器官的分布以及动力学特点。因此，研究小分子配体与人血清白蛋白的结合能力及配体亲和力是评价其潜在用途的关键指标之一。目前也有很多用于测定小分子与大分子相互作用的方法，如表面等离子体共振、荧光偏振技术、动态光散射法以及等温滴定量热法，但都存在一定的局限性，微量热泳动技术不需要改变分子的大小和质量，也不需要固定样品，并且其所需的样品量极少，特别适合于复杂生物样品的测量，且测定的灵敏度高，准确性好。近红外光谱法(NearInfraredSpectroscopy,NIRS)是一种快速、无损、绿色环保的分析技术。由于其光谱区信息量丰富，且绝大多数的物质在该谱区都有响应，因此不仅能够反映各物质的化学信息，且能通过间接分析得到物质的物理及生物信息，具有全息性特点，被广泛应用于农业、食品、化工以及制药等行业。桂皮醛作为桂枝挥发油中的主要成分和有效成分，其开发离不开生产过程的实时监控，对于中药的复杂体系，近红外光谱法为其提供了很好地解决方案。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种桂枝有效成分潜在用途的评价方法和其生产过程的监测方法。本专利技术包含一种桂枝有效成分潜在用途的评价方法和其生产过程的监测方法，前者的特征在于，该方法首次运用微量热泳动技术测定桂皮醛与人血清白蛋白的相互作用，从配体亲和力的角度评价其潜在用途；后者的特征在于应用近红外光谱法对桂枝有效成分桂皮醛生产过程的实时监控。1.桂枝有效成分桂皮醛的潜在用途评价方法：(1)购买检测实验所需要的实验材料：浓度为1mg/mL经Cy5生物荧光染料标记过的人血清白蛋白(北京华菁美达科技有限公司)，桂皮醛分析标准品(上海诗丹德标准技术服务有限公司)；pH7.4的Trident1MTris.HCl缓冲溶液(北京百诺威生物科技有限公司)；PEG400表面活性剂(北京百诺威生物科技有限公司)；(2)浓度为1mg/mL经Cy5生物荧光染料标记过的人血清白蛋白(北京华菁美达科技有限公司)，桂皮醛分析标准品(上海诗丹德标准技术服务有限公司)；pH7.4的Trident1MTris.HCl缓冲溶液(北京百诺威生物科技有限公司)；PEG400表面活性剂(北京百诺威生物科技有限公司)；(3)配制检测实验所需要的溶液：①缓冲溶液的制备：取浓度为1.0mol/L的pH7.4Tris.HCl缓冲溶液0.5mL，9.5mL去离子水稀释至5.0mmol/mL，备用；②人血清白蛋白受试液的制备：取1.0mg/mL的人血清白蛋白2.0μL，用5.0mmol/mL的Tris.HCl缓冲溶液；③桂皮醛受试液的制备：取1.32mg桂皮醛标准品，加入0.5mLPEG400，然后用①中稀释后的Tris.HCl缓冲溶液溶解定容至2mL,5.0mmol/mL作为初始浓度的桂皮醛受试储备液；④微量热泳动仪测试液的制备：取12支PCR小管，编号1-12，分别向2-12号小管中加入①中稀释后的缓冲溶液，接着取③中初始浓度的桂皮醛受试储备液20μL置于1号PCR管中，从1号管中取10μL至2号管中，混合均匀后吸取10μL至3号管；将3号管中的溶液混合均匀后吸取10μL至4号管；依此等比稀释至12号管；接着取配制好的人血清白蛋白受试液10μL至1-12号管中，混合均匀即得MST测试液；(4)微量热泳动仪参数设置：使用微量热泳动仪对②中的人血清白蛋白受试液进行预测试，根据预测试结果设定测量参数如下：受体浓度(TargetConcentration):30nM，LED灯颜色(ExcitationPower):红色，LED灯功率(ExcitationPower):40％，红外激光功率(MSTPower):40％；(5)桂皮醛与人血清白蛋白亲和力的测定：按(3)的结果设定仪器参数，然后按桂皮醛的实际浓度设置配体初始浓度(LigandConcentration)，接着设定测定的温度，取12根毛细管吸取(2)④中编号1-12的桂皮醛与人血清白蛋白的测试样品，将样品置于仪器内孵育五分钟后开始进行测量，分别测定25℃、30℃、35℃、37℃和40℃下桂皮醛与人血清白蛋白的相互作用；(6)数据处理与结果分析：将分析软件计算得到的五个不同温度下解离常数Kd值进行数据处理并分析。2.桂枝有效成分桂皮醛的生产过程监测方法：(1)购买实验材料：桂枝药材(购自北京本草方源药业有限公司)，桂皮醛标准品(中国食品药品研究院，批号110710-201217)，香豆素标准品(成都曼斯特生物科技有限公司，批号12020801)，娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)，提取用水为自制高纯水；(2)样品制备及检测：称取桂枝药材7kg置于100L夹套式多功能提取罐中，加10倍水，提取2次，首次4h，第二次2h。在提取过程中每隔一定时间在线采集近红外光谱，同时进行HPLC检测；(3)近红外光谱在线采集：第一次煎煮加热过程中，每5min采集光谱一次；加热沸腾2h期间每5min采集一次光谱,加热沸腾后2-4h期间每10min采集一次光谱；第二次煎煮加热过程，每5min采集光谱一次；加热沸腾后0-1h每5min采集一次光谱，1-2h每10min采集一次光谱；上述过程共收集到65个样品；采用光纤透射方式采集光谱，以仪器内置背景作为参比。光谱采集范围：800～2200nm，分辨率：0.5nm，扫描次数32次，室温20℃，相对湿度35％；(4)高效液相法含量测定：①对照品溶液的制备：分别精密称取桂皮醛和香豆素对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成2.0994mg/mL和0.0992mg/mL的溶液，即得；②供试品溶液的制备：由于供试品原液浓度较大，需要对原液进行如下稀释：第一次煎煮加热过程取2.5mL样品原液于25mL容量瓶中，加入50％甲醇稀释至刻度，过0.45μm滤膜滤过，取滤液，即得；煮沸阶段取2.5mL样品原液于25mL容量瓶中，加入50％甲醇稀释至刻度，用0.45μm滤膜滤过，取滤液，即得；第二次煎煮煮沸过程取5mL样品原液于25mL容量瓶中，加入50％甲醇稀释至刻度，过0.45μm滤膜滤过，取滤液，即得；③色谱条件：色谱柱：DIKMADiamonsilC18色谱柱(250×4.6mm,5μm)；流动相：A为乙腈，B为0.1％冰醋酸溶液；洗脱方法为梯度洗脱，见表1；流速:1.0mL/min；柱温：35℃；检测波长：285nm；进样10μL；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种桂皮醛的潜在用途评价方法，其特征在于，运用微量热泳动技术测定桂皮醛与人血清白蛋白的相互作用，从配体亲和力的角度评价其潜在用途，步骤如下：(1)实验材料：经Cy5生物荧光染料标记过的人血清白蛋白，桂皮醛分析标准品；Trident 1M Tris.HCl缓冲溶液；PEG400表面活性剂；(2)配制检测溶液：①缓冲溶液的制备：取浓度为1.0mol/L的Tris.HCl缓冲溶液，用去离子水稀释，备用；②人血清白蛋白受试液的制备：取人血清白蛋白，用①中的Tris.HCl缓冲溶液溶解；③桂皮醛受试液的制备：取桂皮醛标准品，加入PEG400，然后用①中的Tris.HCl缓冲溶液溶解定容，作为初始浓度的桂皮醛受试储备液；④微量热泳动仪测试液的制备：取12支PCR小管，编号1‑12，分别向2‑12号小管中加入①中稀释后的缓冲溶液，接着取③中初始浓度的桂皮醛受试储备液20μL置于1号PCR管中，从1号管中取10μL至2号管中，混合均匀后吸取10μL至3号管；将3号管中的溶液混合均匀后吸取10μL至4号管；依此等比稀释至12号管；接着取配制好的人血清白蛋白受试液至1‑12号管中，混合均匀即得MST测试液；(3)微量热泳动仪参数设置：使用微量热泳动仪对②中的人血清白蛋白受试液进行预测试，根据预测试结果设定测量参数；(4)桂皮醛与人血清白蛋白亲和力的测定：按(3)的结果设定仪器参数，然后按桂皮醛的实际浓度设置配体初始浓度，接着设定测定的温度，取12根毛细管吸取(2)④中编号1‑12的桂皮醛与人血清白蛋白的测试样品，将样品置于仪器内孵育一定时间后开始测定桂皮醛与人血清白蛋白的相互作用；(5)数据处理与结果分析：使用微量热泳动仪的内置软件NT Analysis Software计算得到不同温度下解离常数Kd值进行数据处理并分析，得到桂皮醛与人血清白蛋白的结合能力以及热力学参数。...

【技术特征摘要】
1.一种桂皮醛的潜在用途评价方法，其特征在于，运用微量热泳动技术测定桂皮醛与人血清白蛋白的相互作用，从配体亲和力的角度评价其潜在用途，步骤如下：(1)实验材料：经Cy5生物荧光染料标记过的人血清白蛋白，桂皮醛分析标准品；Trident1MTris.HCl缓冲溶液；PEG400表面活性剂；(2)配制检测溶液：①缓冲溶液的制备：取浓度为1.0mol/L的Tris.HCl缓冲溶液，用去离子水稀释，备用；②人血清白蛋白受试液的制备：取人血清白蛋白，用①中的Tris.HCl缓冲溶液溶解；③桂皮醛受试液的制备：取桂皮醛标准品，加入PEG400，然后用①中的Tris.HCl缓冲溶液溶解定容，作为初始浓度的桂皮醛受试储备液；④微量热泳动仪测试液的制备：取12支PCR小管，编号1-12，分别向2-12号小管中加入①中稀释后的缓冲溶液，接着取③中初始浓度的桂皮醛受试储备液20μL置于1号PCR管中，从1号管中取10μL至2号管中，混合均匀后吸取10μL至3号管；将3号管中的溶液混合均匀后吸取10μL至4号管；依此等比稀释至12号管；接着取配制好的人血清白蛋白受试液至1-12号管中，混合均匀即得MST测试液；(3)微量热泳动仪参数设置：使用微量热泳动仪对②中的人血清白蛋白受试液进行预测试，根据预测试结果设定测量参数；(4)桂皮醛与人血清白蛋白亲和力的测定：按(3)的结果设定仪器参数，然后按桂皮醛的实际浓度设置配体初始浓度，接着设定测定的温度，取12根毛细管吸取(2)④中编号1-12的桂皮醛与人血清白蛋白的测试样品，将样品置于仪器内孵育一定时间后开始测定桂皮醛与人血清白蛋白的相互作用；(5)数据处理与结果分析：使用微量热泳动仪的内置软件NTAnalysisSoftware计算得到不同温度下解离常数Kd值进行数据处理并分析，得到桂皮醛与人血清白蛋白的结合能力以及热力学参数。2.如权利要求1所述的一种桂皮醛的潜在用途评价方法，其特征在于：步骤(1)中d的Trident1MTris.HCl缓冲溶pH为7.4。3.如权利要求1或2所述的一种桂皮醛的潜在用途评价方法，其特征在于：步骤(2)①中缓冲溶液的浓度范围为2-10mmol/ml，步骤(2)②中人血清白蛋白受试液的浓度范围3-7mmol/ml，步骤(2)③中初始浓度的桂皮醛受试储备液的浓度范围为2-10mmol/ml，步骤(2)④中人血清白蛋白受试液的体积范围为10-30μL。4.如权利要求1-3之一所述的一种桂皮醛的潜在用途评价方法，其特征在于：步骤(4)中孵育的时间大于等于5分钟，测定的温度范围为15℃-45℃。5.一种桂皮醛的生产过程监测方法，其特征在于，应用近红外光谱法对桂枝有效成分桂皮醛生产过程的实时监控，步骤如下：(1)实验材料：桂枝药材，桂皮醛标准品，娃哈哈纯净水；(2)样品制备及检测：称取桂枝药材置于夹套式多功能提取罐中，加水提取；在提取过程中每隔一定时间在线采集近红外光谱，同时进行HPLC检测；(3)近红外光谱在线采集：第一次煎煮加热过程中，每5min采集光谱一次；加热沸腾2h期间每5mi...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴志生，马丽娟，乔延江，黄兴国，
申请(专利权)人：北京中医药大学，
类型：发明
国别省市：北京,11