具有优异抗钙化性能的血管移植组织及其制备方法技术

本发明专利技术提供一种具有优异抗钙化性能的血管移植组织，通过将具有分泌功能的脂肪细胞覆盖并生长至血管移植物外膜上形成，脂肪细胞由动物自体脂肪干细胞诱导分化而成，血管移植物为脱细胞血管材料；其制备方法包括如下步骤：a、制取脱细胞血管材料备用；b、诱导动物自体脂肪干细胞分化成具有分泌功能的脂肪细胞，并将所得的脂肪细胞制成脂肪细胞片；c、将制得的脂肪细胞片覆盖在脱细胞血管材料外膜上，从而使脂肪细胞联结成片状材料并且生长至脱细胞血管材料外膜上。本发明专利技术制得的血管移植组织移植后在体内的有效时间长，有利于推迟二次手术时间，减缓患者痛苦与经济负担。

Vascular graft tissue with excellent calcification resistance and its preparation method

The present invention provides a vascular graft tissue with excellent anti-calcification property, which is formed by covering and growing adipocytes with secretory function onto the adventitia of the vascular graft. The adipocytes are induced and differentiated by autologous adipose stem cells of animals, and the vascular graft is an acellular vascular material; the preparation method comprises the following steps: Steps: a. Preparation of acellular vascular materials for reserve; B. Induction of animal autologous adipose stem cells to differentiate into secretory adipocytes, and the obtained adipocytes into adipocyte sheets; C. The prepared adipocyte sheets were coated on the adventitia of acellular vascular materials, so that adipocytes were bound to sheet materials. And grow to the outer membrane of acellular vascular material. The vascular transplantation tissue prepared by the invention has a long effective time in vivo after transplantation, is beneficial to postponing the second operation time, and alleviates the pain and economic burden of the patients.

【技术实现步骤摘要】
具有优异抗钙化性能的血管移植组织及其制备方法
本专利技术涉及医药生物材料领域，具体涉及一种具有优异抗钙化性能的血管移植组织及其制备方法。
技术介绍
近年来，尽管血管腔内治疗得到迅速发展，但传统的血管移植手术仍是处理心血管疾病的重要手段，尤其对于治疗大部分复杂先天性心脏病和部分周围血管疾病目前还处于不可替代的地位；血管移植术就是将人工血管移植在机体病变的血管部位，替换异常血管，重新建立血流通路。血管移植后两周是机体免疫炎症发生的高峰，移植用的血管移植物内渗入机体的促炎症细胞越多，预示血管的生物相容性越差及更高的远期的钙化水平。因此，为了避免血管移植物在体内出现上述问题，需要研制出一种具有优异抗钙化性能的血管移植组织，使得血管移植物在患者体内有效时期延长，推迟二次手术的时间，减少患者医疗经济负担，延长患者寿命。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供一种具有优异抗钙化性能的血管移植组织，将动物自体脂肪干细胞分化并制作为具有分泌功能的脂肪细胞片，然后应用于血管移植物上，从而建立新型的抗钙化的组织工程血管材料。本专利技术提供的具有优异抗钙化性能的血管移植组织，通过将具有分泌功能的脂肪细胞覆盖并生长至血管移植物外膜上形成；进一步，所述脂肪细胞由动物自体脂肪干细胞诱导分化而成；进一步，所述血管移植物为脱细胞血管材料。本专利技术还公开了一种具有优异抗钙化性能的血管移植组织的制备方法，包括如下步骤：a、制取脱细胞血管材料备用；b、诱导动物自体脂肪干细胞分化成具有分泌功能的脂肪细胞，并将所得的脂肪细胞制成脂肪细胞片；c、将步骤b中的脂肪细胞片覆盖在步骤a中的脱细胞血管材料外膜上，从而使脂肪细胞联结成片状材料并且生长至脱细胞血管材料外膜上，即可制成具有优异抗钙化性能的血管移植组织；进一步，所述步骤b中，诱导动物自体脂肪干细胞分化用的成脂分化培养液由基础细胞培养液混合地塞米松、吲哚美辛、胰岛素和异丁基甲基黄嘌呤(IBXM)制成；进一步，所述基础细胞培养液为含有10％牛血清、1.0％抗生素的DMEM细胞培养液；所述成脂分化培养液地塞米松、吲哚美辛、胰岛素、异丁基甲基黄嘌呤(IBXM)的浓度分别为1μmol/L、200μmol/L、0.5μg/mL、0.5mmol/L；进一步，所述抗生素为青霉素或链霉素。本专利技术的有益效果：本专利技术将动物自体脂肪干细胞分化而来的脂肪细胞做成脂肪细胞片，应用在脱细胞血管材料表面，利用了脂肪细胞分泌炎症因子的功能，减轻了血管移植物的发生炎症反应的程度，延迟了血管移植物在动物体内的钙化进程，从而使得血管移植物体内有效时限得以延长，有利于推迟二次手术时间，减缓患者痛苦与经济负担，延长患者寿命。附图说明下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步描述：图1为脱细胞血管材料HE染色处理后图；图2为脱细胞血管材料与新鲜血管材料中DNA含量对比图；图3为检测SVF(脂肪间充质干细胞)细胞表面抗原CD34结果；图4为检测SVF细胞表面抗原CD166结果；图5为检测SVF细胞表面抗原ABCG2结果；图6为检测SVF细胞表面抗原CD29结果；图7为油红“O”脂肪染色法鉴定脂肪细胞结果图；图8为HE染色鉴定脂肪细胞片覆盖在脱细胞血管材料表面结果图；图9为酶联免疫吸附测定SVF细胞分化为脂肪细胞前后的HGF的表达水平图；图10为酶联免疫吸附测定SVF细胞分化为脂肪细胞前后的VEGF的表达水平图；图11为酶联免疫吸附测定SVF细胞分化为脂肪细胞前后的APN的表达水平图；图12为实验组的血管移植组织植入体内四周后取出进行APN抗体免疫荧光染色测试结果图；图13为对照组的脱细胞血管材料植入体内四周后取出进行APN抗体免疫荧光染色测试结果图；图14为取第8周时血管移植物经HE染色的结果图，其中，Decellularizedgroup为对照组，iACStreatedgroup为实验组；图15为取四个时间点的血管移植物经HE染色的结果图，其中，Decellularizedgroup为对照组，iACStreatedgroup为实验组；图16为取四个时间点的对照组中M1型巨噬细胞及M2型单核巨噬细胞的渗入量柱状图；图17为取四个时间点的实验组中M1型巨噬细胞及M2型单核巨噬细胞的渗入量柱状图；图18为对照组与实验组中M1：M2结果的对比图；图19为采用VonKossa硝酸银染色评价实验组和对照组的血管钙化情况结果图；图20为对实验组和对照组进行原子火焰法检测钙化程度的结果图。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。实施例一一、血管移植组织的制备1、脱细胞血管材料制备采用动物颈动脉脱细胞处理制成脱细胞血管材料，具体包括如下步骤：(1)首先将生理盐水清洗后的动物颈动脉置于低渗离子水中，并在4℃温度下，持续振荡漂洗12h；(2)然后对漂洗后的主动脉进行浸泡洗涤，洗涤过程为：依次采用1％TritonX-100、去离子水、1％SDS(十二烷基硫酸钠)进行洗涤，每种试剂洗涤3h，且更换洗涤试剂之前均需采用PBS(磷酸盐缓冲液)清洗三次，每次5分钟，重复该洗涤过程至少5遍。上述洗涤步骤中均需按浓度为5μmol/L、1g/L、100mg/L分别加入苯甲基磺酸氟(蛋白酶抑制剂)、抗生素头孢咗啉钠、链霉素，且每一步洗涤均在4℃振荡器中持续振荡；(3)再将洗涤后的颈动脉浸泡于胰酶和乙二胺四乙酸的混合溶液中，在37℃条件下震荡1h；其中，混合溶液中，胰酶的质量浓度为0.05％，乙二胺四乙酸的质量浓度为0.02％，溶剂为去离子水；(4)将步骤(3)所得的颈动脉在PBS中浸泡洗涤12h，在4℃振荡器中持续振荡进行洗涤，PBS每3h需更换一次，然后用0.1％过氧乙酸消毒30min；(5)对步骤(4)制得的脱细胞血管材料效果进行鉴定后，将脱细胞血管材料应用常规程序冻干处理后密封保存。2、动物自体脂肪干细胞的提取1)分离大鼠腹股沟皮下脂肪组织，置于含有抗生素(青霉素或链霉素)的D-Hank，s溶液中涮洗，去除脂肪筋膜组织，之后用手术剪将脂肪组织剪碎成1mm左右的小颗粒,加入适量0.2％Ⅱ型胶原酶的PBS溶液，在37℃条件下消化90min；2)向步骤(1)中加入等体积的含10％胎牛血清的DMEM-LG培养基终止消化，并用200目筛网过滤，去除未消化的组织,留取滤液；3)将步骤(2)中所得滤液在1000×g离心10min(离心半径为15cm),丢弃脂肪细胞层和上层液体，收集细胞沉淀；4)将细胞沉淀用DMEM-LG培养基(含15％胎牛血清)重悬，接种于带透气孔的T25细胞培养瓶中,在5％CO2、37℃标准环境下进行SVF原代培养，当细胞团贴壁时，更换培养基，并除去未贴壁细胞，之后每2-3天更换一次培养基,待细胞长到70-80％融合时，即可进行消化传代培养；5)消化传代培养：弃去上层培养基，采用预热(37℃)的PBS溶液冲洗细胞2次，然后加入预热(37℃)的0.25％胰蛋白酶(含EDTA)，待细胞回缩成球状，脱离培养皿时，立即加入含10％胎牛血清的培养基终止消化，然后回收悬液，并将悬液在1000rpm离心5min，弃去上清液；6)按1:2传代：本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有优异抗钙化性能的血管移植组织，其特征在于：通过将具有分泌功能的脂肪细胞覆盖并生长至血管移植物外膜上形成。

【技术特征摘要】
1.一种具有优异抗钙化性能的血管移植组织，其特征在于：通过将具有分泌功能的脂肪细胞覆盖并生长至血管移植物外膜上形成。2.根据权利要求1所述的具有优异抗钙化性能的血管移植组织，其特征在于：所述脂肪细胞由动物自体脂肪干细胞诱导分化而成。3.根据权利要求1所述的具有优异抗钙化性能的血管移植组织，其特征在于：所述血管移植物为脱细胞血管材料。4.一种具有优异抗钙化性能的血管移植组织的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：a、制取脱细胞血管材料备用；b、诱导动物自体脂肪干细胞分化成具有分泌功能的脂肪细胞，并将所得的脂肪细胞制成脂肪细胞片；c、将步骤b中的脂肪细胞片覆盖在步骤a中的脱细胞血管材料外膜上，从而使脂肪细胞联结成片状材料并且生长至脱细胞血管材料外膜上，即可制成具有优异...

【专利技术属性】
技术研发人员：王强，亦桐，
申请(专利权)人：中国医学科学院阜外医院，
类型：发明
国别省市：北京,11