糖缀合物制造技术

本发明专利技术涉及糖缀合物。具体而言，本发明专利技术涉及通过使用稳定的硝酰基相关的试剂/氧化剂作为氧化物质来制备的包含与载体蛋白缀合的糖的糖缀合物以及包含此类糖缀合物的免疫原性组合物。

Glycoconjugate

The present invention relates to glycoconjugates. Specifically, the present invention relates to glycoconjugates containing sugars conjugated with carrier proteins and immunogenic compositions containing such glycoconjugates prepared by using a stable nitroyl-related reagent/oxidant as an oxidant.

【技术实现步骤摘要】
糖缀合物本申请是2013年12月13日提交的专利技术名称为“糖缀合方法”的中国专利申请201380066823.8的分案申请。
概括而言，本专利技术涉及通过使用TEMPO/NCS作为氧化物质(oxidizingagent)来制备包含与载体蛋白缀合的糖的糖缀合物(glycoconjugate)的方法、包含此类糖缀合物的免疫原性组合物以及使用此类糖缀合物和免疫原性组合物的方法。本专利技术还涉及通过在选择性氧化糖的伯羟基的氧化剂的存在下使用稳定的硝酰基或氮氧(nitroxide)自由基(例如哌啶-N-氧基或吡咯烷-N-氧基)化合物制备包含与载体蛋白缀合的糖的糖缀合物的方法、包含此类糖缀合物的免疫原性组合物以及使用此类糖缀合物和免疫原性组合物的方法。
技术介绍
使用与蛋白载体连接的多糖(通常来自细菌的表面包衣)制备多糖蛋白缀合物疫苗。多糖与蛋白载体的化学键合诱导针对在其表面上展现疫苗内所包含的多糖的细菌的免疫应答，由此预防疾病。因此，使用来自致病细菌的多糖的疫苗接种是增强宿主免疫力的潜在策略。覆盖细菌的多糖大为不同，甚至在单一细菌物种内也是如此。例如，在肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae，全世界范围内婴儿和幼儿的脑膜炎、肺炎及严重的侵袭性疾病的主要诱因)中，由于细菌多糖包衣的变化而具有超过90种不同的血清型。因此，多糖疫苗通常由一组多糖组成以增加保护。尽管多糖自身是免疫原性的，但多糖与蛋白载体的缀合已用于改善免疫原性。载体蛋白可以是来自靶标病原体的增强对该病原体的特异性免疫应答的相关蛋白抗原，或是主要作为佐剂或一般免疫应答刺激剂的一般免疫原性蛋白。多价肺炎球菌多糖-蛋白缀合物疫苗已经被许可多年，并且已证明在预防婴儿的肺炎球菌疾病方面是有价值的，并且最近已经推荐用于成人。
技术实现思路
在一个方面，本专利技术提供了制备包含与载体蛋白缀合的糖的糖缀合物的方法，其包括以下步骤：a)使糖与2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧基(TEMPO)和N-氯代琥珀酰亚胺(NCS)在水性溶剂中反应以产生活化的糖；以及b)使所述活化的糖与包含一个或多个氨基的载体蛋白反应。在另一方面，所述活化的糖的氧化度为1至50、1至40、1至30、1至20、1至10、1至5、3至40、3至30、3至20、3至10、4至40、4至30、4至20、4至10、5至30、5至25、5至20、5至10、6至50、6至40、6至30、6至20、6至15、6至14、6至13、6至12、6至11、6至10、7至40、7至30、7至20、7至15、7至14、7至13、7至12、7至11、7至10、8至40、8至30、8至20、8至15、8至14、8至13、8至13、8至12、8至11、8至10、9至40、9至30、9至20、9至15、10至40、10至30、10至20或10至15。在另一方面，所述活化的糖的氧化度为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40。在另一方面，本专利技术提供了制备包含与载体蛋白缀合的糖的糖缀合物的方法，其包括以下步骤：a)在选择性氧化糖的伯羟基的氧化剂的存在下，使所述糖与稳定的硝酰基或氮氧自由基化合物如哌啶-N-氧基或吡咯烷-N-氧基化合物反应以产生包含醛基的活化的糖；以及b)使所述活化的糖与包含一个或多个氨基的载体蛋白反应。在所述反应中，实际的氧化剂为催化性循环的N-氧代铵盐(N-oxoammoniumsalt)。优选地，所述稳定的硝酰基或氮氧自由基化合物具有在氧化剂的存在下将伯醇选择性氧化成醛而不过度氧化成羧酸的能力。在一方面，反应的步骤a)在水性溶剂中进行。在另一方面，步骤a)在非质子溶剂中进行。在一方面，步骤a)在DMSO(二甲亚砜)、二甲基乙酰胺(DMA)、环丁砜、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、六甲基磷酰胺(HMPA)中或在DMF(二甲基甲酰胺)溶剂中进行。在一方面，未反应的醛基在与载体蛋白缀合之后使用硼氢化物在加帽步骤中被转化回伯醇，由此使在涉及氧化及随后的缀合的修饰步骤期间的糖表位修饰最小化。在一方面，所述稳定的硝酰基或氮氧自由基化合物是哌啶-N-氧基或吡咯烷-N-氧基化合物。优选地，所述化合物具有在氧化剂的存在下选择性氧化伯醇以生成醛基而不影响仲羟基的能力。更优选地，所述化合物具有在氧化剂的存在下选择性氧化伯醇以生成醛基而不过度氧化成羧基的能力。在一方面，所述稳定的硝酰基或氮氧自由基化合物带有TEMPO或PROXYL(2,2,5,5-四甲基-1-吡咯烷氧基)部分。优选地，所述化合物具有在氧化剂的存在下选择性氧化伯醇以生成醛基而不影响仲羟基的能力。更优选地，所述化合物具有在氧化剂的存在下选择性氧化伯醇以生成醛基而不过度氧化成羧基的能力。在一方面，所述稳定的硝酰基化合物是TEMPO或其衍生物。在一个方面，所述稳定的硝酰基化合物选自TEMPO、2,2,6,6-四甲基-4-(甲基磺酰氧基)-1-哌啶氧基、4-膦酰氧基-TEMPO、4-氧代-TEMPO、4-甲氧基-TEMPO、4-异硫氰酸基-TEMPO、4-(2-碘乙酰氨基)-TEMPO自由基、4-羟基-TEMPO、4-氰基-TEMPO、4-羧基-TEMPO、4-(2-溴乙酰氨基)-TEMPO、4-氨基-TEMPO、4-乙酰氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶1-氧基。优选地，所述硝酰基化合物是TEMPO。在另一方面，所述稳定的硝酰基化合物选自3β-DOXYL-5α-胆甾烷、5-DOXYL-硬脂酸、16-DOXYL-硬脂酸、5-DOXYL-硬脂酸甲酯、3-(氨基甲基)-PROXYL、3-氨甲酰基-PROXYL、3-氨甲酰基-2,2,5,5-四甲基-3-吡咯啉-1-氧基、3-羧基-PROXYL、3-氰基-PROXYL。在一个方面，所述氧化剂是带有N-卤代部分的分子。优选地，所述分子具有在硝酰基化合物的存在下选择性氧化伯醇的能力。在一个方面，所述氧化剂选自N-氯代琥珀酰亚胺、N-溴代琥珀酰亚胺、N-碘代琥珀酰亚胺、二氯异氰尿酸、1,3,5-三氯-1,3,5-三嗪-2,4,6-三酮、二溴异氰尿酸、1,3,5-三溴-1,3,5-三嗪-2,4,6-三酮、二碘异氰尿酸以及1,3,5-三碘-1,3,5-三嗪-2,4,6-三酮。优选地，所述氧化剂为N-氯代琥珀酰亚胺。在一方面，所述活化的糖的氧化度为1至50、1至40、1至30、1至20、1至10、1至5、3至40、3至30、3至20、3至10、4至40、4至30、4至20、4至10、5至30、5至25、5至20、5至10、6至50、6至40、6至30、6至20、6至15、6至14、6至13、6至12、6至11、6至10、7至40、7至30、7至20、7至15、7至14、7至13、7至12、7至11、7至10、8至40、8至30、8至20、8至15、8至14、8至13、8至13、8至12、8至11、8至10、9至40、9至30、9至20、9至15、10至40、10至30、10至20或10至15。在另一方面，所述活化的糖的氧化度为1、2、3、4、5、6、7、8、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.包含与载体蛋白缀合的细菌荚膜多糖的糖缀合物，其通过包括以下步骤的方法产生或可通过包括以下步骤的方法获得：a)使细菌荚膜多糖与稳定的硝酰基化合物和氧化剂反应以产生活化的细菌荚膜多糖；以及b)使所述活化的细菌荚膜多糖与包含一个或多个氨基的载体蛋白反应，其中所述氧化剂为具有在硝酰基化合物的存在下选择性氧化伯醇以产生醛基的能力的带有N‑卤代部分的分子。

【技术特征摘要】
2012.12.20 US 61/740,3111.包含与载体蛋白缀合的细菌荚膜多糖的糖缀合物，其通过包括以下步骤的方法产生或可通过包括以下步骤的方法获得：a)使细菌荚膜多糖与稳定的硝酰基化合物和氧化剂反应以产生活化的细菌荚膜多糖；以及b)使所述活化的细菌荚膜多糖与包含一个或多个氨基的载体蛋白反应，其中所述氧化剂为具有在硝酰基化合物的存在下选择性氧化伯醇以产生醛基的能力的带有N-卤代部分的分子。2.如权利要求1所述的糖缀合物，其中所述稳定的硝酰基化合物为具有在氧化剂的存在下选择性氧化伯醇以产生醛基而不影响仲羟基的能力的哌啶-N-氧基或吡咯烷-N-氧基化合物。3.如权利要求1所述的糖缀合物，其中所述稳定的硝酰基化合物为具有在氧化剂的存在下选择性氧化伯醇以产生醛基而不影响仲羟基的能力的带有TEMPO或PROXYL(2,2,5,5-四甲基-1-吡咯烷氧基)部分的分子。4.如权利要求1所述的糖缀合物，其中所述硝酰基化合物选自TEMPO、2,2,6,6-四甲基-4-(甲基磺酰氧基)-1-哌啶氧基、4-膦酰氧基-TEMPO、4-氧代-TEMPO、4-甲氧基-TEMPO、4-异硫氰酸基-TEMPO、4-(2-碘乙酰氨基)-TEMPO自由基、4-羟基-TEMPO、4-氰基-TEMPO、4-羧基-TEMPO、4-(2-溴乙酰氨基)-TEMPO、4-氨基-TEMPO和4-乙酰氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶1-氧基。5.如权利要求1所述的糖缀合物，其中所述硝酰基化合物选自3β-DOXYL-5α-胆甾烷、5-DOXYL-硬脂酸、16-DOXYL-硬脂酸、5-DOXYL-硬脂酸甲酯、3-(氨基甲基)-PROXYL、3-氨甲酰基-PROXYL、3-氨甲酰基-2,2,5,5-四甲基-3-吡咯啉-1-氧基、3-羧基-PROXYL和3-氰基-PROXYL。6.如权利要求1所述的糖缀合物，其中所述硝酰基化合物为TEMPO或其衍生物。7.如权利要求1所述的糖缀合物，其中所述氧化剂为N-氯代琥珀酰亚胺。8.如权利要求1所述的糖缀合物，其中所述反应的步骤a)在水性溶剂或非质子溶剂中进行。9.如权利要求1所述的糖缀合物，其中所述糖与0.5摩尔当量至1.5摩尔当量的氧化剂反应。10.如权利要求1所述的糖缀合物，其中所述稳定的硝酰基化合物以催化量存在。11.如权利要求1所述的糖缀合物，其中所述糖与少于约0.3摩尔当量的稳定的硝酰基化合物反应。12.包含与载体蛋白缀合的细菌荚膜多糖的糖缀合物，其通过包括以下步骤的方法产生：a)使细菌荚膜多糖与2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧基(TEMPO)和N-氯代琥珀酰亚胺(NCS)在水性溶剂中反应以产生活化的细菌荚膜多糖；以及b)使所述活化的细菌荚膜多糖与包含一个或多个氨基的载体蛋白反应。13.如权利要求1至12中任一项所述的糖缀合物，其中所述载体蛋白为CRM197。14.如权利要求1至13中任一项所述的糖缀合物，其具有约600kDa至约2800kDa、约700kDa至约2700...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·韩，R·K·凯因森，JH·金，A·K·普拉萨德，
申请(专利权)人：辉瑞公司，
类型：发明
国别省市：美国,US