防治牙周炎的DNA疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种新型的DNA疫苗、制备方法以及其在制备防治牙周炎药物中的用途；所述DNA疫苗为pVAX1‑HA2‑fimA重组质粒，是由牙龈卟啉单胞菌W83型的牙龈素‑血凝素基因编码区的核心功能区HA2、菌毛蛋白基因fimA基因和真核表达载体pVAX1质粒构成。实验证明，采用本发明专利技术构建的DNA疫苗免疫SD大鼠，能成功诱导在唾液中产生特异性SIgA，从而诱导动物机体产生免疫应答，具有较好的免疫原性，进而抑制SD大鼠牙周炎的发生。

DNA vaccine for prevention and treatment of periodontitis and its preparation method

The present invention discloses a novel DNA vaccine, a preparation method and its application in the preparation of periodontitis drugs; the DNA vaccine is a recombinant plasmid pVAX1_HA2_fimA, which is the core functional region HA2, fimA gene and eukaryotic surface of the gingival hemagglutinin gene coding region of Porphyromonas gingivalis W83. Plasmid pVAX1 was constructed. The experiment proves that the DNA vaccine constructed by the invention can successfully induce the production of specific SIgA in saliva of SD rats, thereby inducing the immune response of the animal body, and has good immunogenicity, thereby inhibiting the occurrence of periodontitis in SD rats.

【技术实现步骤摘要】
防治牙周炎的DNA疫苗及其制备方法
本专利技术属于口腔疾病防治医学
，具体涉及一种DNA疫苗、制备方法以及其在防治牙周炎中的用途。
技术介绍
牙周病是引起牙齿丧失的主要口腔疾病之一，也是危害人类口腔和全身健康的主要疾病；慢性牙周炎是导致成人牙齿功能丧失的主要原因，发病率高。牙周病对牙周组织造成的破坏是持续且不可逆的，一旦发生，以目前的治疗手段很难达到完全康复。此外，牙周病还与某些全身疾病密切相关，是诱发某些系统性疾病如糖尿病、心血管系统疾病等的危险因素，许多临床研究表明牙周病与这些全身疾病相互影响，甚至互为因果。牙周病还可能导致新生儿早产与低体重。最近的研究表明，在患有牙周病的早产低体重儿的母体中，产妇的静脉血清和脐带血清中各炎性因子水平明显升高，且母体牙周病变程度越高，婴儿孕周越小，出生体重越低。因此，从各个方面来说，探索有效的防治牙周病的药物或疫苗对于提高国民整体健康水平有着重要意义。牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis，P.gingivalis)是牙周炎的主要致病菌之一，其在慢性牙周炎和侵袭性牙周炎等口腔疾病的发生发展中发挥着重要的作用。P.gingivalis含有大量的特异性毒力因子，如菌毛、血凝素、脂多糖及蛋白酶等，介导P.gingivalis对牙周组织黏附、定植，进而破坏牙周组织结构。近年来随着分子生物学与免疫学技术的不断成熟，尤其是P.gingivalis基因组DNA被成功测序，为筛选作为疫苗的候选基因提供了可靠的依据。针对上述靶点设计基因疫苗，发挥相应的免疫效应是可行的。牙龈素是P.gingivalis细胞表面的特异性半胱氨酸蛋白酶，存在于P.gingivalis外膜、膜泡或胞外，是重要的毒力因子，能直接参与牙周组织的破坏，并使P.gingivalis逃避宿主的免疫防御机制，同时也反映了不同时期的P.gingivalis在牙周炎患者病变部位的比例变化，在P.gingivalis致牙周病的发生发展过程中占据相当重要的地位。牙龈素编码基因分别为rgpA、rgpB和kgp，分别编码RgpA、RgpB和Kgp蛋白。其中Kgp、RgpA、RgpB的免疫原性各不相同，有研究人员通过实验验证Kgp、RgpA的免疫原性较RgpB强。rgpA基因包括催化结构域和血凝集素黏附结构域(hemagglutininA,hagA)，其中hagA基因分为四段，分别编码HA1、HA2、HA3、HA4结构域，其中HA2为P.gingivalis的关键区域。大量基因水平的分析表明，HA2基因具有调控介导细菌凝集并破坏红细胞，黏附至牙周组织，破坏牙周组织形态的作用。另有研究报道HA2基因缺陷的菌株，凝血实验结果显著小于正常的菌株，证实其在P.gingivalis中具有凝血作用。根据Genbank中已公布的rgpA基因的序列，结合其已公布HA2蛋白序列编号，对应找到其基因编码区为第4357-4861(GI：U15282)。同时，菌毛也是P.gingivalis表面的主要毒力因子之一，菌毛是P.gingivalis表面卷曲的丝状蛋白，它能介导P.gingivalis的定植及其与革登链球菌(Streptococcusgordonii，S.gordonii)的共聚，与P.gingivalis侵入到牙周组织的上皮细胞和结缔组织内有关；同时可刺激致炎性细胞因子的产生，导致骨质吸收和其他炎症反应。菌毛蛋白主要的亚单位为FimA，为其主要的抗原成分，次要成分为FimC、FinD、FimE，分别为fimA下游的fimC、fimD、fimE基因编码，在细胞黏附及定植中发挥重要作用。因此菌毛蛋白基因也是构建牙周炎基因疫苗应用最广泛的抗原基因。同时fimA基因位于血凝素基因的下游，与血凝素基因紧密相连，从基因水平分析，血凝素与菌毛蛋白之间具有相互协调的可能性。现阶段，基因疫苗已经成为探索防治疾病的一种有效的新措施，作为基因疫苗的重组质粒进入胞内，与细胞同时进行增殖与表达，产生分泌蛋白至胞外，诱导抗原-抗体反应产生体液免疫，同时具有表面抗原效应的抗原可以表达于细胞膜上，从而诱导细胞免疫。因其具有体液免疫及细胞免疫的双重免疫效应，使其成为优于传统灭活疫苗及减毒疫苗的新型疫苗。同时，构建靶向基因疫苗成为现阶段研究的热点，将多种基因串联，以增强其免疫效应。
技术实现思路
本专利技术设计将牙龈素-血凝素基因编码区的核心功能区HA2、菌毛蛋白基因fimA基因整合到真核表达质粒上，制备DNA疫苗，用于口腔牙周炎防治的研究。据此，本专利技术提供了一类新型的DNA疫苗、制备方法以及其在防治牙周炎中的用途。具体地：一方面，本专利技术提供了一种新型的DNA疫苗，为pVAX1-HA2-fimA重组质粒，是由牙龈卟啉单胞菌W83型的牙龈素-血凝素基因编码区的核心功能区HA2基因和菌毛蛋白基因fimA基因经IRES基因序列连接后，插入真核表达载体pVAX1质粒得到。本专利技术所述的DNA疫苗，为pVAX1-HA2-fimA重组质粒，经酶切去除pVAX1载体后，得到的HA2-fimA的DNA序列如SEQID:2所示。另一方面，本专利技术还提供了上述为pVAX1-HA2-fimA重组质粒的DNA疫苗的制备方法，该制备方法包括如下步骤：(1)、牙龈素-血凝素基因编码区的核心功能区HA2和菌毛蛋白基因fimA基因及IRES序列的克隆；(2)、pVAX1-HA2-fimA重组质粒的构建并转化感受态细胞，筛选重组质粒；(3)、重组质粒酶切后进行DNA测序鉴定，得到的HA2-fimA的DNA序列如SEQID:2所示。一种优选的实施方式，上述为pVAX1-HA2-fimA重组质粒的DNA疫苗的制备方法，该制备方法包括如下步骤：(1)、牙龈素-血凝素基因编码区的核心功能区HA2、菌毛蛋白基因fimA基因及IRES基因的克隆，HA2和fimA基因通过IRES基因序列连接后得到HA2-fimA重组基因片段；(2)、将步骤(1)中获得的HA2-fimA重组基因片段插入到pVAX1质粒，构建pVAX1-HA2-fimA重组质粒，并转化感受态细胞DH5α，得到的pVAX1-HA2-fimA重组质粒；(3)、步骤(2)得到的pVAX1-HA2-fimA重组质粒，经酶切鉴定正确后进行DNA测序，得到的HA2-fimA的DNA序列如SEQID:2所示。上述为pVAX1-HA2-fimA重组质粒的制备方法；其各个步骤优选，但不限于，如下的操作：所述步骤(1)的操作优选为：1)、根据Genbank公布的HA2、fimA以及pIRE2-EGFP的图谱中的IRES序列设计引物，并进行引物合成，引物合成工作由上海(生工)生物工程有限公司完成；2)、牙龈卟啉单胞菌W83型的培养及基因组DNA的提取；3)、pVAX1及pIRES2-EGFP质粒的提取；4)、牙龈素-血凝素基因编码区的核心功能区HA2、菌毛蛋白基因fimA基因及IRES基因的克隆，HA2和fimA基因通过IRES基因序列连接后得到HA2-fimA重组基因片段，HA2-fimA重组基因的PCR扩增。更优选地，所述步骤(1)、牙龈素-血凝素基因编码区的核心功能区HA2和菌毛蛋白基因fimA基因、连接片段IRES序列的克隆，获得的片段进行二次拼本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种DNA疫苗，为pVAX1‑HA2‑fimA重组质粒，是由牙龈卟啉单胞菌W83型的牙龈素‑血凝素基因编码区的核心功能区HA2基因和菌毛蛋白基因fimA基因经IRES基因序列连接后，插入真核表达载体pVAX1质粒得到。

【技术特征摘要】
1.一种DNA疫苗，为pVAX1-HA2-fimA重组质粒，是由牙龈卟啉单胞菌W83型的牙龈素-血凝素基因编码区的核心功能区HA2基因和菌毛蛋白基因fimA基因经IRES基因序列连接后，插入真核表达载体pVAX1质粒得到。2.根据权利要求1所述的DNA疫苗，其特征在于，所述的pVAX1-HA2-fimA重组质粒，经酶切去除pVAX1质粒后，得到的HA2-fimA的DNA序列如SEQID:2所示。3.根据权利要求1或2所述的DNA疫苗的制备方法，包括如下步骤：(1)、牙龈素-血凝素基因编码区的核心功能区HA2和菌毛蛋白基因fimA基因及IRES序列的克隆；(2)、pVAX1-HA2-fimA重组质粒的构建并转化感受态细胞，筛选重组质粒；(3)、重组质粒酶切后进行DNA测序鉴定，得到的HA2-fimA的DNA序列如SEQID:2所示。4.根据权利要求3所述的DNA疫苗的制备方法，其特征在于；包括如下步骤：(1)、牙龈素-血凝素基因编码区的核心功能区HA2、菌毛蛋白基因fimA基因及IRES基因的克隆，HA2和fimA基因通过IRES基因序列连接后得到HA2-fimA重组基因片段；(2)、将步骤(1)中获得的HA2-fimA重组基因片段插入到pVAX1质粒，构建pVAX1-HA2-fimA重组质粒，并转化感受态细胞DH5α，得到的pVAX1-HA2-fimA重组质...

【专利技术属性】
技术研发人员：白国辉，田源，管晓燕，喻正文，刘建国，王倩，陈彬，吴明松，王方远，
申请(专利权)人：遵义医学院，
类型：发明
国别省市：贵州,52