结合蒙脱石封闭活性炭的BCAC-EMA-Rti-LAMP的活菌检测方法技术

本发明专利技术提供一种结合蒙脱石封闭活性炭的EMA‑Rti‑LAMP的活菌检测方法，先以蒙脱石封闭活性炭去除检测样品中干扰PCR聚合酶活性的抑制剂，然后加入叠氮溴化乙锭进行反应，再对经过叠氮溴化乙锭处理的样品提取DNA模板；再进行Rti‑LAMP扩增反应，根据反应结果获取活菌数量。本发明专利技术的检测方法通过BCAC消减检测样品中干扰PCR聚合酶活性的抑制剂，结合EMA‑Rti‑LAMP检测方法对非预增菌的经过前处理精制的检测样品，能够在5h内从食品样品中检测低至5CFU/g活的E.coli O157:H7，适用于肉类样品和蔬菜类样品，也可应用于其他类食品样品，具有操作简便、耗时短、快速可靠、灵敏度高。

Detection of viable BCAC-EMA-Rti-LAMP with montmorillonite closed activated carbon

The invention provides an EMA_Rti_LAMP live bacteria detection method combined with montmorillonite blocked activated carbon. First, the inhibitor interfering with PCR polymerase activity in the detected sample is removed by montmorillonite blocked activated carbon, then the reaction is carried out by adding ethidium azide bromide, and then the DNA template is extracted from the sample treated by ethidium azide bromide. The Rti LAMP amplification reaction was performed and the number of viable bacteria was obtained according to the reaction results. The detection method of the present invention can detect E.coli O157:H7 as low as 5 CFU/g living in food samples within 5 hours by BCAC subtraction detection of inhibitors interfering with PCR polymerase activity in samples, combined with EMA_Rti_LAMP detection method for non-pre-processed refined detection samples of pre-enriched bacteria, and is suitable for meat samples and vegetable samples. It can also be applied to other kinds of food samples with simple operation, short time-consuming, fast and reliable, high sensitivity.

【技术实现步骤摘要】
结合蒙脱石封闭活性炭的BCAC-EMA-Rti-LAMP的活菌检测方法
本专利技术属于生物检测领域，具体涉及结合蒙脱石封闭的活性炭(BCAC)、EMA(ethidiumbromidemonoazide)及实时荧光环介导等温扩增技术(Rti-LAMP)实现快速特异性活菌检测。
技术介绍
大肠杆菌O157:H7(E.coliO157:H7)是肠出血性大肠杆菌中最常见的血清型，也是其多种血清型中最主要的致病菌株，感染剂量低于5CFU。感染该菌可使人患腹泻、出血性结肠炎(hemorhabiccolitis,HC)，还可引发溶血性尿毒综合征(hemolyticuremicsyndrome，HUS)及血栓性血小板减少紫癜(thromboticthrombocytopenicpurpura，TTP)等严重并发症，致死率达5％～10％。目前检测E.coliO157:H7的方法主要有传统分离培养、免疫学和分子生物学检测。这些方法在不同的检测要求下都有各自的优点，但是也都存在着一定的不足，比如耗费时间长、操作过程繁琐以及检测灵敏度低等。环介导等温扩增技术自2000年日本科学家Notomi专利技术报道以来，因其可在等温条件下数十分钟内完成核酸的高倍扩增，从而成为继PCR技术之后又一新型更快速、简便的分子生物学检测技术。目前各国研究人员在此基础上发展出了多种病原菌的LAMP检测方法。与PCR等其他方法相比，LAMP有着其独特的优点，如在等温条件下即可完成扩增反应、反应时间短(40-60min)、灵敏度比较高、而且反应温度比较低(60-65℃)，甚至可肉眼直接判断反应结果。然而这种基于核酸扩增的分子生物检测方法不能区分活、死细胞，因而无法准确定量检测样品中活菌浓度。叠氮溴化乙锭(ethidiummonoazide，EMA)能够穿透破损的细胞壁或细胞膜与DNA共价结合形成耦合物，使其不能发生扩增反应。本专利技术将EMA结合Rti-LAMP实现快速定量检测活的E.coliO157:H7。研究表明食品中存在多种水溶性DNA聚合酶抑制剂，会干扰PCR等分子生物学方法检测食品中致病菌。活性炭是一种具有较大表面积、复杂孔隙结构的物质，具有良好的吸附性能，可以用来消减干扰PCR聚合酶活性的抑制剂。但由于活性炭同时能吸附细菌，需要对其表面进行适当封闭，从而防止细菌被吸附。本专利技术使用蒙脱石封闭的活性炭可以消减食品中水溶性抑制剂，同时不影响食品中细菌的回收。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种避免受干扰PCR聚合酶活性的抑制剂干扰的活菌检测方法，能够更快地实现食品检测样品中活菌的定量检测。为了实现上述目的，本专利技术提供一种结合蒙脱石封闭活性炭的EMA-Rti-LAMP的活菌检测方法，所述方法包括以下步骤：(1)以蒙脱石封闭活性炭去除检测样品中干扰PCR聚合酶活性的的抑制剂，得到精制检测样品；(2)向所述精制检测样品中加入叠氮溴化乙锭进行反应；(3)对经过叠氮溴化乙锭处理的样品提取DNA模板；(4)对步骤(3)的DNA模板进行Rti-LAMP扩增反应，根据反应结果获取活菌数量。在本专利技术中，“检测样品中干扰PCR聚合酶活性的抑制剂”应当理解为检测样品中干扰PCR聚合酶活性、影响PCR或者LAMP扩增的物质，其通常具有水溶性，包括水溶性蛋白及色素等物质。如肉类食品中的蛋白质、酶、抗生素、血红蛋白、多糖、脂肪等，以及蔬菜类食品中的多糖、酚类化合物、叶绿素等。在本专利技术中，所述蒙脱石封闭活性炭是通过以下制备方法得到的：(1)颗粒活性炭的处理：取粒径为0.5-3mm的颗粒活性炭，用水清洗至流出的水无色清亮，在55℃下烘干备用；(2)蒙脱石封闭剂的制备：按以g/mL计取1份蒙脱石和50份去离子水，混合后高速匀浆，然后以700rpm离心1min，取上清为封闭剂，备用；(3)蒙脱石封闭活性炭的制备：以步骤(2)的封闭剂浸没步骤(1)的颗粒活性炭，在35-40℃下摇床中100-150rpm封闭2-4h，然后弃上清，烘干后得到蒙脱石封闭活性炭。根据一种优选的实施方式，步骤(1)中，按以g/mL计取25份检测样品和50-100份缓冲液，均质1min后在500-800g下离心5min，取上清，用玻璃棉过滤后再在8000-12000g下离心5min，所得沉淀用20-30份缓冲液重悬，得到重悬液；取4-5份蒙脱石封闭活性炭，以缓冲液润洗后加入到重悬液中，室温下100-180rpm下吸附10-20min，随后溶液经玻璃棉过滤后10000g下离心5min，所得沉淀用缓冲液重悬得到二次重悬液，所述二次重悬液为精制检测样品。根据一种优选的实施方式，步骤(2)中，向所述精制检测样品加入叠氮溴化乙锭使其终浓度为4-8μg/mL，黑暗处理5min后，然后置于卤素灯下处光照10-20min，然后在8000-12000g下离心10-15min，所得沉淀用1×TZ裂解液重悬，沸水浴加热10min。根据一种优选的实施方式，步骤(4)中，所述Rti-LAMP的反应体系总量为25μL，所述反应体系包括：根据一种优选的实施方式，骤(4)中，根据Rti-LAMP反应结果，设定Rti-LAMP出现指数扩增时荧光值500处的时间为Tt值，建立Tt值与目标菌浓度的标准曲线，然后根据标准曲线定量检测样品中活菌浓度。在本专利技术中，所述检测样品为食品，包括但不限于肉类、蔬菜、水果或干制品。在本专利技术中，所述活菌是大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌、单增李斯特菌、副溶血性弧菌等食源性致病菌。作为一种实施方式，当检测对象为大肠杆菌O157:H7，其检测引物包括：内引物FIP：GCT-CTT-GAT-GCA-TCT-CTG-GTA-CAC-TCA-CTG-GTT-TCA-TCA-TAT-CTG-G；内引物BIP：CTG-TCA-CAG-CAG-AAG-CCT-TAC-GGA-CGA-AAT-TCT-CCC-TGT-ATC-TGC-C；环引物LoopF：TGT-ATT-ACC-ACT-GAA-CTC-CAT-TAA-CG；环引物LoopB：GGC-ATT-TCC-ACT-AAA-CTC-CAT-TAA-CG；外引物F3：CAG-TTA-TAC-CAC-TCT-GCA-ACG-TG；外引物B3：CTG-ATT-CGC-CGC-CAG-TTC。对于其他致病菌，本领域技术人员根据现有技术的记载，能够设计具体的检测引物，故不做赘述。LAMP扩增技术可参考……(建议给出教科书)通过实验证明，本专利技术提供的EMA-Rti-LAMP检测方法结合上述蒙脱石封闭活性炭非预增菌前处理精制样品，能够在5h内完成活菌检测，本专利技术具有以下优点：操作简便、耗时短、快速可靠、灵敏度高。【附图说明】图1为实施例一中蒙脱石封闭活性炭的工艺流程图；图2为实施例一中蒙脱石封闭的活性炭及吸附抑制剂的电镜效果示意图；图3、图4为实施例三中评价EMA-Rti-LAMP方法的定量能力的结果示意图；图5、图6为实施例四中评价BCAC-EMA-Rti-LAMP定量检测鸡肉中活的E.coliO157:H7结果示意图。图7为实施例四中评价BCAC-EMA-Rti-LAMP定量检测生菜中E.coliO157:H7活菌的结果示意图【具体实施方式】以下实施例用于非限制性地解释本专利技术的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种结合蒙脱石封闭活性炭的BCAC‑EMA‑Rti‑LAMP的活菌检测方法，所述方法包括以下步骤：(1)以蒙脱石封闭活性炭去除检测样品中干扰PCR聚合酶活性的抑制剂，得到精制检测样品；(2)向所述精制检测样品中加入叠氮溴化乙锭进行反应；(3)对经过叠氮溴化乙锭处理的样品提取DNA模板；(4)对步骤(3)的DNA模板进行Rti‑LAMP扩增反应，根据反应结果获取活菌数量。

【技术特征摘要】
1.一种结合蒙脱石封闭活性炭的BCAC-EMA-Rti-LAMP的活菌检测方法，所述方法包括以下步骤：(1)以蒙脱石封闭活性炭去除检测样品中干扰PCR聚合酶活性的抑制剂，得到精制检测样品；(2)向所述精制检测样品中加入叠氮溴化乙锭进行反应；(3)对经过叠氮溴化乙锭处理的样品提取DNA模板；(4)对步骤(3)的DNA模板进行Rti-LAMP扩增反应，根据反应结果获取活菌数量。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述蒙脱石封闭活性炭是通过以下制备方法得到的：(1)颗粒活性炭的处理：取粒径为0.5-3mm的颗粒活性炭，用水清洗至流出的水无色清亮，烘干备用；(2)蒙脱石封闭剂的制备：按以g/mL计取1份蒙脱石和50份去离子水，混合后高速匀浆，然后以700rpm离心1min，取上清为封闭剂，备用；(3)蒙脱石封闭活性炭的制备：以步骤(2)的封闭剂浸没步骤(1)的颗粒活性炭，在35-40℃下摇床中100-150rpm封闭2-4h，然后弃上清，烘干后得到蒙脱石封闭活性炭。3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于步骤(1)中，按以g/mL计取25份检测样品和50-100份缓冲液，均质1min后在500-800g下离心5min，取上清，用玻璃棉过滤后再在8000-12000g下离心5min，所得沉淀用20-30份缓冲液重悬，得到重悬液；取4-5份蒙脱石封闭活性炭，以缓冲液润洗后加入到重悬液中，室温下100-180rpm下吸附10-20min，随后溶液经玻璃棉过滤后8000-12000g下离心5min，所得沉淀用缓冲液重悬得到二次重悬液，所述二次重悬液为精制检测样品。4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于步骤(2)中，向所...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴国平，赵远洋，汤凯洁，
申请(专利权)人：江西农业大学，
类型：发明
国别省市：江西,36