微卫星标记鉴定鲫鱼倍性的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了微卫星标记鉴定鲫鱼倍性的方法，所述方法包括以下步骤：(1)开发微卫星序列，设计、筛选引物；(2)采集鲫鱼尾部鳍条，提取基因组DNA；(3)以鳍条基因组DNA为模板进行PCR扩增；(4)将步骤(3)获得的PCR扩增产物用ABI3730测序仪进行毛细管电泳检测；(5)分析ABI3730测序仪的峰值图。与现有技术相比，本发明专利技术具有以下优点：(1)本发明专利技术所述的微卫星标记具有特异性强，灵敏度高，扩增效率好的优点；(2)本发明专利技术所述方法较传统的染色体核型以及流式细胞方法操作性强，成本降低，时间缩短；(3)本发明专利技术所述方法在不损伤鱼体的前提下能够准确、快速的鉴定鲫鱼倍性。

Identification of ploidy in crucian carp by microsatellite markers and its application

The invention discloses a method for identifying ploidy of crucian carp by microsatellite marker. The method comprises the following steps: (1) developing microsatellite sequence, designing and screening primers; (2) collecting tail fins of crucian carp and extracting genomic DNA; (3) PCR amplification using genomic DNA of fin as template; (4) PCR amplification products obtained by step (3) using ABI 3730 The sequencing instrument was detected by capillary electrophoresis. (5) the peak map of ABI3730 sequencing instrument was analyzed. Compared with the prior art, the invention has the following advantages: (1) the microsatellite marker described in the invention has the advantages of strong specificity, high sensitivity and good amplification efficiency; (2) the method described in the invention is more operable, lower cost and shorter time than the traditional chromosome karyotype and flow cytometry methods; (3) the method described in the invention. The ploidy of Carassius auratus can be identified accurately and quickly without damaging the fish.

【技术实现步骤摘要】
微卫星标记鉴定鲫鱼倍性的方法及其应用
本专利技术属于分子生物学
，涉及一种采用分子标记的方法鉴定鲫鱼种质的方法，具体为微卫星标记鉴定鲫鱼倍性的方法及其应用。
技术介绍
鲫鱼在分类上属鲤科，鲤亚科，鲫属，广泛分布在中国、日本、朝鲜半岛，后移植引种驯化到印度、北美和世界各地，适应能力极强，目前世界各地均有分布。鲫有两个亚种：鲫(Carassiusauratus)和银鲫(Carassiusauratusgibelio)，以及红鲫、白鲫、金鱼等多个变种。它们染色体数目各异，倍性不一，目前认为：银鲫是三倍体物种(3n＝150+)，如方正银鲫；红鲫、白鲫和金鱼为二倍体物种(2n＝100)。在长江以及大型湖泊水域中，同时存在染色体数不同的鲫鱼，有二倍体，三部体，甚至还存在少量的四倍体群体，但很难通过外形以及侧线鳞数目来判断鲫鱼倍性。为了更好的利用和保护鲫鱼种质资源，需要对鲫鱼进行倍性鉴定。鲫鱼多倍体的鉴定，可通过染色体制备或流式细胞仪来完成，虽然结果准确，但费时费力，特别是鉴定大批量的个体时，比如繁殖用的亲本，很难通过上述方法完成。此时更需要一种快速批量化的方法来鉴定鲫鱼多倍体。微卫星标记(Microsatellite)，是广泛分布在真核生物基因组中的简单重复序列，其位点通过PCR扩增，ABI3730测序仪对荧光标记的DNA片段进行检测，结合分子量内标进行DNA片段长度计算，使STR分型变得高效快捷，结果也更加精确。
技术实现思路
解决的技术问题：为了克服现有技术的不足，获得一种快速、准确地鲫鱼倍性鉴定方法，本专利技术提供了微卫星标记鉴定鲫鱼倍性的方法及其应用。技术方案：微卫星标记鉴定鲫鱼倍性的方法，所述方法包括以下步骤：(1)开发微卫星序列，设计、筛选引物，选用的11对微卫星引物为：Caraur1，SEQIDNO.1～2；Caraur2，SEQIDNO.3～4；Caraur3，SEQIDNO.5～6；Caraur4，SEQIDNO.7～8；Caraur5，SEQIDNO.9～10；Caraur6，SEQIDNO.11～12；Caraur7，SEQIDNO.13～14；Caraur8，SEQIDNO.15～16；Caraur9，SEQIDNO.17～18；Caraur10，SEQIDNO.19～20；Caraur11，SEQIDNO.21～22；(2)采集鲫鱼尾部鳍条，提取基因组DNA；(3)以鳍条基因组DNA为模板进行PCR扩增；(4)将步骤(3)获得的PCR扩增产物用ABI3730测序仪进行毛细管电泳检测；(5)分析ABI3730测序仪的峰值图。优选的，步骤(1)中的引物采用荧光标记，具体为：Caraur1，Caraur4，Caraur7，Caraur8，Caraur11的荧光染料标记物为FAM；Caraur2，Caraur3，Caraur5，Caraur6，Caraur9，Caraur10的荧光染料标记物为HEX。11对微卫星引物的具体信息如表1所示：表111对微卫星引物具体信息优选的，步骤(3)中PCR扩增的体系为15μL，包括10×反应缓冲液1.5μL，Mg2+2mmol/L，dNTP200μmol/L，上下游引物各0.1μmol/L，Taq酶0.25U，DNA50ng～100ng，灭菌双蒸水补足至15μL；PCR反应条件为：94℃3min；94℃15s，56～60℃30s，72℃30s，28个循环；72℃延伸5min。优选的，步骤(4)的具体操作为：采用琼脂糖凝胶电泳结果估算步骤(3)中PCR产物的浓度，并将产物稀释20倍后，与GeneScanTM500LIZ内标，大小分别为35、50、75、100、139、150、160、200、250、300、340、350、400、450、490和500混匀，置于ABI3730测序仪样本架上进行毛细管电泳检测，同时检测两种STR类型，FAM和HEX标记；毛细管电泳反应体系为：20倍稀释的PCR产物2μL，超纯去离子甲酰胺8μL，GeneScanTM500LIZ的分子量标记0.085μL。优选的，步骤(5)中峰值图的分析标准为：11对引物中，至少1对引物的结果出现3个峰值时，为三倍体鲫鱼，至少1对引物的结果出现2个峰值，且无3个峰值时，为二倍体鲫鱼。实际判断过程中，需结合多个微卫星标记的峰值图，判别鉴定鲫鱼个体倍性。以上任一所述方法在鲫鱼种质鉴定中的应用。有益效果：(1)本专利技术所述的微卫星标记具有特异性强，灵敏度高，扩增效率好的优点；(2)本专利技术所述方法较传统的染色体核型以及流式细胞方法操作性强，成本降低，时间缩短；(3)本专利技术所述方法在不损伤鱼体的前提下能够准确、快速的鉴定鲫鱼倍性。附图说明图1是Caraur1在家系2的个体中扩增峰值图；图2是Caraur1在家系1的个体中扩增峰值图；图3是Caraur11在家系1的个体中扩增峰值图；图4是Caraur11在家系2的个体中扩增峰值图；图5是1号家系样品的肾细胞染色体图；图6是2号家系样品的肾细胞染色体图。具体实施方式以下实施例进一步说明本专利技术的内容，但不应理解为对本专利技术的限制。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1试验对象：选择太湖野生鲫鱼，一对一繁殖，构建12个全同胞家系，从每个家系后代中随机选择5尾，共计60尾鱼用于多倍性鉴定。微卫星标记鉴定鲫鱼倍性的方法，所述方法包括以下步骤：(1)开发微卫星序列，设计、筛选引物，选用的11对微卫星引物为：Caraur1，SEQIDNO.1～2；Caraur2，SEQIDNO.3～4；Caraur3，SEQIDNO.5～6；Caraur4，SEQIDNO.7～8；Caraur5，SEQIDNO.9～10；Caraur6，SEQIDNO.11～12；Caraur7，SEQIDNO.13～14；Caraur8，SEQIDNO.15～16；Caraur9，SEQIDNO.17～18；Caraur10，SEQIDNO.19～20；Caraur11，SEQIDNO.21～22；上述引物采用荧光标记，具体为：Caraur1，Caraur4，Caraur7，Caraur8，Caraur11的荧光染料标记物为FAM；Caraur2，Caraur3，Caraur5，Caraur6，Caraur9，Caraur10的荧光染料标记物为HEX。11对微卫星引物的具体信息如表1所示：表111对微卫星引物具体信息(2)采集待鉴别鲫鱼尾部的鳍条，置于1.5mL离心管中，加95％酒精保存。提取DNA时，用滤纸吸干鳍条上附着的酒精，剪碎，用E.Z.N.ATMTissueDNAKit(OmegaBio-tek)试剂盒提取基因组DNA；(3)以鳍条基因组DNA为模板进行PCR扩增；PCR扩增的体系为15μL，包括10×反应缓冲液1.5μL，Mg2+2mmol/L，dNTP200μmol/L，上下游引物各0.1μmol/L，Taq酶0.25U，DNA50ng～100ng，灭菌双蒸水补足至15μL；PCR反应条件为：94℃3min；94℃15s，56～60℃30s，72℃30本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.微卫星标记鉴定鲫鱼倍性的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)开发微卫星序列，设计、筛选引物，选用的11对微卫星引物为：Caraur1，SEQ ID NO.1～2；Caraur 2，SEQ ID NO.3～4；Caraur3，SEQ ID NO.5～6；Caraur4，SEQ ID NO.7～8；Caraur5，SEQ ID NO.9～10；Caraur6，SEQ ID NO.11～12；Caraur7，SEQ ID NO.13～14；Caraur8，SEQ ID NO.15～16；Caraur9，SEQ ID NO.17～18；Caraur10，SEQ ID NO.19～20；Caraur11，SEQ ID NO.21～22；(2)采集鲫鱼尾部鳍条，提取基因组DNA；(3)以鳍条基因组DNA为模板进行PCR扩增；(4)将步骤(3)获得的PCR扩增产物用ABI3730测序仪进行毛细管电泳检测；(5)分析ABI3730测序仪的峰值图。

【技术特征摘要】
1.微卫星标记鉴定鲫鱼倍性的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)开发微卫星序列，设计、筛选引物，选用的11对微卫星引物为：Caraur1，SEQIDNO.1～2；Caraur2，SEQIDNO.3～4；Caraur3，SEQIDNO.5～6；Caraur4，SEQIDNO.7～8；Caraur5，SEQIDNO.9～10；Caraur6，SEQIDNO.11～12；Caraur7，SEQIDNO.13～14；Caraur8，SEQIDNO.15～16；Caraur9，SEQIDNO.17～18；Caraur10，SEQIDNO.19～20；Caraur11，SEQIDNO.21～22；(2)采集鲫鱼尾部鳍条，提取基因组DNA；(3)以鳍条基因组DNA为模板进行PCR扩增；(4)将步骤(3)获得的PCR扩增产物用ABI3730测序仪进行毛细管电泳检测；(5)分析ABI3730测序仪的峰值图。2.根据权利要求1所述的微卫星标记鉴定鲫鱼倍性的方法，其特征在于，步骤(1)中的引物采用荧光标记，具体为：Caraur1，Caraur4，Caraur7，Caraur8，Caraur11的荧光染料标记物为FAM；Caraur2，Caraur3，Caraur5，Caraur6，Caraur9，Caraur10的荧光染料标记物为HEX。3.根据权利要求1所述的微卫星标记鉴定鲫鱼倍性的方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐永凯，王美垚，李建林，刘凯，李红霞，于凡，俞菊华，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，
类型：发明
国别省市：江苏,32