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一种用于肝癌早期诊断的生物标志物及其应用制造技术

技术编号:18885612 阅读:51 留言:0更新日期:2018-09-08 07:15
本发明专利技术具体涉及一种肠道微生态标志物及其应用。本发明专利技术提供了一种用于肝癌诊断的生物标志物,由SEQ ID NO:1‑34所示的34种基因组成,所述基因在肠道中富集。本发明专利技术还提供一种用于检测试剂,包括用于检测SEQ ID NO:1‑34所示的34种基因的引物。本发明专利技术通过无创的方法收集入组患者的粪便,进行肠道菌群的16S rRNA Miseq测序。在标志物发现期,通过随机森林法,在早期肝硬化肝癌患者、肝硬化患者和健康对照之间,鉴定早期肝癌特异性的微生物基因标志物,建立肝癌患病率(probability of disease,POD)指数,实现自身标志物发现期的验证。在标志物验证期,计算验证期患者的POD指数,实现POD指数对于验证期肝癌患者的诊断价值的验证。

Biomarker for early diagnosis of hepatocellular carcinoma and its application

The invention relates specifically to an intestinal microecological marker and its application. The present invention provides a biomarker for the diagnosis of hepatocellular carcinoma, which is composed of 34 genomes shown in SEQ ID NO:1_34. The gene is enriched in the intestine. The invention also provides a detection reagent comprising a primer for detecting 34 genes shown in SEQ ID NO:1_34. The invention collects the feces of the patients in the treatment group by a non-invasive method and sequences the 16S rRNA Miseq of the intestinal flora. In the period of marker discovery, random forest method was used to identify the specific microbial gene markers of early hepatocellular carcinoma (HCC) among patients with early cirrhosis, patients with liver cirrhosis and healthy controls, and to establish the probability of disease (POD) index, so as to verify the detection period of self-markers. During the marker validation period, the POD index was calculated to validate the diagnostic value of POD index for the patients with hepatocellular carcinoma in the validation period.

【技术实现步骤摘要】
一种用于肝癌早期诊断的生物标志物及其应用
本专利技术属于生物医药
,具体涉及一种肠道微生态标志物及其应用。
技术介绍
肝癌是全球范围内肿瘤相关死亡的第三位主要原因。在美国,目前男性有预计29200例新发的肝癌患者,女性有11510例新发的肝癌患者。在中国由于乙肝病毒持续感染及其引起的肝硬化的流行,导致肝癌的发病情况更严重,男性有343700例新发肝癌患者,女性有122300例新发肝癌患者。由于肝癌早期缺乏特异性症状和有效的早期诊断标志物,大部分肝癌患者诊断时已是晚期,预后很差(死亡率/发生率的整体比例约0.95)。因此,当下亟需新型的诊断标志物和新型的治疗策略来改善肝癌患者的预后。人体肠道微生态是机体最重要的微生态系统。它不仅作为肠道炎症的关键决定因子,而且在慢性肝脏疾病中发挥重要作用。肠道微生态的改变促进多种慢性肝脏疾病的进展,包括酒精性肝脏疾病、非酒精性脂肪性肝脏疾病、肝硬化及其并发症。近来的动物实验指出肠道微生态通过微生态-肝脏轴促进肝细胞的发生发展。然而临床肝癌患者的肠道微生态特征还未曾报道过。肠道微生态作为特定疾病或肿瘤的无创诊断工具正在被广泛认可。QinJ等鉴定和验证了60000个2型糖尿病相关的微生物标志物,指出了区别2型糖尿病的微生物标志物的有效性。YuJ等在不同民族患者中揭示并验证了结直肠癌的微生物标志物,指出微生物标志物作为一种可支付的、无创的结直肠癌的早期诊断标志物。我们之前研究了肝硬化和健康对照的肠道微生物组,建立了基于肠道微生物标志物的患者区分指数。然而,肠道微生物标志物是否能够用于区别早期肝癌还未曾报道过。本专利技术旨在评估肠道微生物组作为肝癌无创标志物的诊断能力。
技术实现思路
本专利技术提供了一种用于肝癌诊断的生物标志物,由SEQIDNO:1-34所示的34种基因组成,所述基因在肠道中富集。另外本专利技术还提供了一种用于检测试剂,包括用于检测SEQIDNO:1-34所示的34种基因的引物。所述引物序列为SEQIDNO:35-36。本专利技术还提供了检测试剂在制备肝癌诊断试剂盒中的应用,所述检测试剂适用于检测SEQIDNO:1-34所示的34种基因。所述肝癌诊断试剂盒适用于肝癌早期筛查和诊断。对所述对象的粪便排泄物进行检测,以便确定是否存在所述生物标志物。通过无创的方法收集入组对象的粪便,进行肠道菌群的16SrRNAMiseq测序,检测是否存在权利要求1所述的生物标志物。进一步的,通过无创的方法收集入组对象的粪便,进行肠道菌群的16SrRNAMiseq测序;在标志物发现期,通过随机森林法,在早期肝硬化肝癌患者、肝硬化患者和健康对照之间,鉴定早期肝癌特异性的微生物基因标志物。具体包括:(1)通过无创的方法收集入组对象的粪便,进行肠道菌群的16SrRNAMiseq测序;(2)在标志物发现期,通过随机森林法,在早期肝硬化肝癌患者、肝硬化患者和健康对照之间,鉴定早期肝癌特异性的微生物基因标志物。(3)建立肝癌患病率(POD)指数,实现自身标志物发现期的验证。(4)在标志物验证期,计算验证期患者的POD指数,实现POD指数对于验证期肝癌患者的诊断价值的验证。(5)同时,入组不同地区的肝癌患者样本,再次实现肠道微生态诊断标志物的跨地区验证。(6)对于早期肝硬化肝癌的诊断,联合肠道微生物标志物建立的患病率(POD)指数和血清AFP可以增强单纯血清AFP对早期肝硬化肝癌的诊断能力,表明POD指数可以作为血清AFP的一种辅助性诊断工具。另外,还提供了一种用于肝癌早期诊断的试剂盒,包括用于检测权利要求1所述的SEQIDNO:1-34所示的34种基因的引物。本专利技术的其操作步骤如下:(1)按照前瞻性样本收集和回顾性盲法评估的设计原则,肠道微生态作为肝癌无创诊断工具的研究设计如图1所示。该研究方案得到了浙江大学医学院第一附属医院和郑州大学第一附属医院伦理委员会的批准。所有入组的患者签署知情同意书。(2)每一个患者提供一份新鲜的粪便样本,分装样本并立即冻存于-80℃。粪便细菌DNA抽提按照试剂盒的说明书进行。(3)完成粪便细菌DNA样本的扩增和DNA文库构建,在IlluminaMiseq测序平台完成16SrRNA测序。所有的输出序列完成基本的预处理和基本的生物信息学分析。(4)从所有样本中随机抽选等量的序列数,按照UPARSE传递途径拼接成对应的16SrRNA基因序列分类单元(OperationalTaxonomyUnits,OTUs)。按照标志物发现期、标志物验证期和独立诊断期,将产生的OTUs收集整理。使用RDP分类器2.6版本注释基于序列。(5)通过基于样本的OTUs分析,使用R软件程序包计算并获得微生物多样性指数,并获得OTUs对应的细菌分类和菌属组成。(6)基于代表性的序列,产生出标志物发现期的OTUs频率文件、验证期OTUs频率文件和独立诊断期OTUs频率文件。这些OTUs用于一个相关性研究来鉴定在患者和健康对照之间差异明显的OTUs丰度。使用Wilcoxon检验联合Benjamin和Hochberg多重检验校正来计算两组之间OTUs频率文件差异的概率。对于特异性,使用一个非常严格的显著阈值:FDR<0.0001。(7)为了阐明粪便微生物组对早期肝癌的诊断价值,我们构建了一个能够特异性鉴定早期肝癌样本的随机森林区分模型。为了鉴定早期肝癌的独特的OTUs标志物,在标志物发现期,我们分别在75例早期肝硬化肝癌和40例肝硬化(模型A)、75例健康对照和75例早期肝硬化肝癌(模型B)、40例肝硬化和75例健康对照(模型C)之间进行5次尝试的10倍交差验证(即50次)(图2)。在每一个模型中,计算5次尝试的交叉验证的错误率并用交叉验证错误曲线显示。基于错误曲线的平均值,最小的错误值作为cut-off值使用。在50次尝试验证中,筛选出低于cut-off值的错误率的OTUs标志物,选择错误率最小的OTUs标志物作为最佳的标志物集。(8)基于标志物发现期的OTUs丰度文件集,通过Leave-one-out(LOO)交叉验证模式,我们使用R软件3.0.2和随机森林软件包4.6-7(除了设置“importance=TRUE,proximity=TRUE,ntree=1000”之外,软件参数默认),来构建随机森林模型。通过使用随机生成的决策树的比率来计算患病率(Probabilityofdisease,POD)指数。决策树预测样本为“HCC”,设置的参数预测为:proximity=T,norm.votes=T,predict.all=TRUE。在LOO模式中构建的150个随机森林模型用于预测验证集中每一个样本的POD指数,最终计算每一个样本的平均预测的POD指数。对于每一个样本,POD指数构建的流程图如图3所示。随后,进一步在标志物验证集和独立诊断集中检验了POD指数,并决定了预测错误率。另外,在早期肝癌样本中,我们进一步分析了POD指数和血清AFP联合标志物的诊断能力。(9)我们从中国的华东(杭州)、华中(郑州)和西北地区(新疆)前瞻性地收集了486例粪便样本。经过严格的病理诊断和排除过程以后,最终419例患者样本纳入研究,完成了肠道微生物16SrRNAMiesq测序。纳入的患者随机分为标志物发现本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种用于肝癌诊断的生物标志物,其特征在于:由SEQ ID NO:1‑34所示的34种基因组成,所述基因在肠道中富集。

【技术特征摘要】
1.一种用于肝癌诊断的生物标志物,其特征在于:由SEQIDNO:1-34所示的34种基因组成,所述基因在肠道中富集。2.一种用于检测权利要求1所述生物标志物的检测试剂,包括用于检测权利要求1所述的SEQIDNO:1-34所示的34种基因的引物。3.根据权利要求1所述的检测试剂,其特征在于:所述引物序列为SEQIDNO:35-36。4.权利要求2所述检测试剂在制备肝癌诊断试剂盒中的应用,所述检测试剂适用于检测权利要求1所述的生物标志物。5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于:所述肝癌诊断试剂盒适用于肝癌早期筛查和诊断。6.根据权利要求2所述的应用,其特征在于:对所述对象的粪便排泄物进行检测,以便确定是否存在所述生物标志物。7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于:通过无创的方法收集入组对象的粪便,进行肠道菌群的16SrRNAMiseq测序,检测是否存在权利要求1所述的生物标志物。8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于:通过无创的方法收集入组对象的粪便,进行肠道菌群的16SrRNAMiseq测序;在标志物发现期,...

【专利技术属性】
技术研发人员:任志刚李昂蒋建文郑树森鲁海峰崔光莹周琳陈新华
申请(专利权)人:浙江大学
类型:发明
国别省市:浙江,33

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