本发明专利技术提供了检测甲基丙二酸血症伴同型半胱氨酸血症CbIC型病症相关联的突变位点及其用药指导相关联的突变位点的试剂盒，并进一步提供了用于检测突变位点的探针组以及扩增所述探针组的引物组的序列信息，通过采用所述探针组或引物鉴定患者相关基因位点的突变情况，从而可以实现对甲基丙二酸血症伴同型半胱氨酸血症CbIC型的患者的准确筛查、诊断，并能够进一步提供针对性的指导叶酸用药治疗。
MMACHC and MTHFR gene mutation detection kit
The present invention provides a kit for detecting mutation sites associated with methylmalonic acidemia with homocysteinemia CbIC type disease and mutation sites associated with medication guidance, and further provides sequence information for a probe group for detecting mutation sites and a primer group for amplifying the probe group by using the described The probes or primers can identify the mutations of related gene loci in patients with methylmalonic acidemia and homocysteinemia, so as to screen and diagnose the patients with CbIC accurately, and provide further guidance for the treatment of folic acid.
【技术实现步骤摘要】
MMACHC、MTHFR基因突变检测试剂盒
本专利技术属于基因检测领域，具体涉及MMACHC、MTHFR基因突变检测试剂盒，主要应用于检测甲基丙二酸血症伴同型半胱氨酸血症CblC型，同时联合应用于叶酸代谢异常检测。
技术介绍
甲基丙二酸血症(methylmalonicacademia，MMA)是先天有机酸代谢异常中最常见的病种，主要是由于甲基丙二酰辅酶A变位酶(mutaseapoenzyme，mut)自身缺陷或其辅酶钴胺素(Cobalamin，Cbl，VitB12)代谢缺陷所致。变位酶缺陷包括完全缺陷mut0型，部分缺陷mut-型。钴胺素代谢缺陷包括cblA、cblB、cblC、cblD、cblE、cblF、cblG和cblH8种亚型，其中cblC、、cblD和cblF可导致辅酶脱氧腺苷钴胺素和甲基钴胺素合成障碍，引起体内甲基丙二酸、同型半胱氨酸等代谢物异常蓄积，故称为甲基丙二酸血症伴同型半胱氨酸血症(简称合并型MMA)。临床表现为神经、肝脏、肾脏、骨髓等多脏器损伤，以cblC型最为常见，其编码基因为MMACHC，定位于染色体1p34.1，属于常染色体隐性遗传病。同时，N5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)，它是人体甲硫氨酸-叶酸代谢过程中的关键酶，也是同型半胱氨酸重新甲基化的关键酶。它可以使N5，10-亚甲基四氢叶酸还原为5-甲基四氢叶酸，从而作为甲基的间接供体参与体内嘌呤、嘧啶的合成及DNA、RNA、蛋白质的甲基化，同时维持体内正常的同型半胱氨酸水平。其编码基因为MTHFR，定位于染色体1p36，也属于常染色体隐形遗传病。MTHFR基因突变导致酶活性下降，使血浆同型半胱胺酸浓度升高及DNA低甲基化，导致甲基丙二酸血症伴同型半胱氨酸血症CblC型患者病情严重，疾病预后差。甲基丙二酸血症合并同型半胱氨酸血症CblC型患者临床表现个体差异性大，临床特征以神经系统症状为主，尤其是脑损伤，可表现为嗜睡、惊厥、运动功能障碍以及手足徐动症等。部分患儿伴有巨幼红细胞性贫血、粒细胞及血小板减少，严重时出现骨髓抑制。部分患儿伴肝肾损伤，肾小管酸中毒、间质性肾炎、慢性肾衰等肾脏衰竭，有时伴有溶血性尿毒症综合征。迟发型患儿多在4岁～14岁出现症状，甚至于成年期起病，常合并脊髓、肝、肾、眼、血管及皮肤等多系统损害，儿童或青少年时期表现为急性神经系统症状，如认知能力下降、意识模糊及智力落后等。目前，甲基丙二酸血症伴同型半胱氨酸血症CblC型的诊断主要通过尿气相色谱/质谱(gaschromatographymassspectrometry，GS/MS)技术检测尿液中甲基丙二酸、血串联质谱(tandemmassspectrometry，MS/MS)技术检测血中丙酰肉碱(C3)与乙酰肉碱(C2)的比值(C3/C2)，两者同时增高并排除维生素B12缺乏等继发因素伴血清同型半胱氨酸升高，可合并甲硫氨酸(methionine，Met)降低时方可诊断。同时应完善患者血、尿常规、血气分析、血氨、血糖、血乳酸、肝肾功能和心肌酶谱测定、脑CT或MRI扫描、脑电图、智力测定等辅助检查。但是该方法的操作复杂，明确诊断费时且价格昂贵，并且对于甲基丙二酸血症伴同型半胱氨酸血症CblC型的筛查及预防不具备普遍的意义。通过对患者进行基因检测，可明确基因突变类型，对甲基丙二酸血症伴同型半胱氨酸血症CblC型患者明确诊断及个体化防治提供有力证据。传统基因检测方法基于Sanger测序，需先明确想要检测的基因，通过聚合酶链扩增技术(PCR)将目标区段扩增出来，再使用双脱氧终止法(Sanger测序)进行测序确定致病突变。该方法通量低、效率差、成本高、且检出率不理想。
技术实现思路
二代测序技术(NGS)以其通量高、成本低、可一次性检测突变范围广的特点，已经发展为重要的临床基因分析技术，而结合目标区域捕获技术(targetregioncapturetechnology)可进一步富集目标区段，提高检测效率降低成本，但目前市场上没有一种产品或技术可以一次性检测MMACHC基因、MTHFR基因的所有外显子区域的SNP位点。本专利技术通过自主科研结果确定了MMACHC基因上的5个高频突变位点和MTHFR基因上的1个高频突变位点，即MMACHC基因上的c.80A＞G、c.482G＞A、c.567dupT、c.609G＞A和c.656_658AAGdel，以及MTHFR基因上的c.665C＞T。通过杂交探针原理合成捕获探针，对目标位置一次性在二代测序平台进行测序，结合自建专病数据库对测序数据进行解读，确定患者的位点突变情况。本方法对MMACHC基因上的c.80A＞G、c.482G＞A、c.567dupT、c.609G＞A和c.656_658AAGdel，以及MTHFR基因上的c.665C＞T这6个突变位点的1X覆盖率达100％，可有效检测上述6个位点的突变情况，从而辅助临床诊断及治疗。前期通过对23个临床上疑似甲基丙二酸血症伴同型半胱氨酸血症CblC型患者样本采用本方法进行检测，MMACHC基因上的c.80A＞G、c.482G＞A、c.567dupT、c.609G＞A和c.656_658AAGdel，以及MTHFR基因上的c.665C＞T这6个位点突变检出率达86.96％，为甲基丙二酸血症伴同型半胱氨酸血症CblC型高频突变位点，可以作为疾病辅助诊断的依据。此外使用此方法还可以不断完善新的突变位点，并简化新的待检测样本的解读流程。针对选取的甲基丙二酸血症伴同型半胱氨酸血症CblC型疾病相关的MMACHC基因上的c.80A＞G、c.482G＞A、c.567dupT、c.609G＞A和c.656_658AAGdel以及叶酸代谢通路相关的MTHFR基因上的c.665C＞T这6个突变位点设计探针组合，本组合中探针对目标区域覆盖度达100％。该探针组可富集突变位点及两侧序列，探针长度为120bp，富集的DNA在二代测序平台上进行高深度测序。根据测序数据进行序列比对及信息分析，对每个变异进行突变类型判定，如果同一位点(locus)上的两个等位基因均发生突变，则为纯合突变；如果同一位点(locus)上的两个等位基因只有一个位置上发生突变，则为杂合突变；如果同一位点(locus)上的两个等位基因均未发生突变，则为野生型。再结合正常人群频率，疾病数据库频率，患者临床症状，遗传模式，所处位点保守性进行致病性判断，辅助临床诊断。具体流程参见图1。本专利技术提供了一种探针组，其特征在于，所述探针组中的探针能够特异性的识别MMACHC基因上的c.80A＞G、c.482G＞A、c.567dupT、c.609G＞A和c.656_658AAGdel，以及MTHFR基因上的c.665C＞T这6个位置的突变：优选的，本专利技术提供的探针组包含SEQIDNO：1-5所示的序列。本专利技术提供一种引物组，所述引物组用于扩增前述探针组。优选的，本专利技术提供的引物组包括SEQIDNO：6-13所示的序列。本专利技术提供一种MMACHC、MTHFR基因突变检测试剂盒，所述试剂盒包括前述探针组和/或引物组。本专利技术进一步请求保护前述探针组和/或引物组的用途，所述用途为用于制备MMACHC、MTHFR基因突变检测。本专利技术进一步公开了与MM本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种探针组，其特征在于，所述探针组中的探针能够特异性的识别甲基丙二酸血症伴同型半胱氨酸血症C型蛋白相关基因(即MMACHC基因)上特定突变位点和亚甲基四氢叶酸还原酶相关基因(即MTHFR基因)上特定突变位点，其中所述MMACHC基因突变位点为c.80A＞G、c.482G＞A、c.567dupT、c.609G＞A和c.656_658AAG del；所述MTHFR基因的突变位点为c.665C＞T。
【技术特征摘要】
1.一种探针组，其特征在于，所述探针组中的探针能够特异性的识别甲基丙二酸血症伴同型半胱氨酸血症C型蛋白相关基因(即MMACHC基因)上特定突变位点和亚甲基四氢叶酸还原酶相关基因(即MTHFR基因)上特定突变位点，其中所述MMACHC基因突变位点为c.80A＞G、c.482G＞A、c.567dupT、c.609G＞A和c.656_658AAGdel；所述MTHFR基因的突变位点为c.665C＞T。2.根据权利要求1所述的探针，其特征在于，所述探针组序列包含SEQIDNO：1-5所示的序列。3.权利要求1-2任一权利要求所述探针组的用途，其特征在于，用于检测甲基丙二酸血症伴同型半胱氨酸血症CblC型。4.权利要求1-2所述探针组的用途，其特征在于，用于检测人体叶酸代谢异常，从而判定同型半胱氨酸代谢水平及用药指导。5.引物组，其特征在于，所述引物...
【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：北京金准基因科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：北京,11
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