一种溶菌质粒及其构建方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种能在37℃仍能抑制溶菌基因E的表达而有利于制备菌蜕时获得更多的菌体的溶菌质粒及其构建和在制备大肠杆菌菌蜕中的应用，其中，该溶菌质粒其特征在于，包括：温敏调控及其启动子基因ΔcI857‑pR、噬菌体溶菌基因E基因、pBV220质粒的rrnB终止子和pUC19质粒载体组成，其中，所述温敏调控及其启动子基因ΔcI857‑pR的pR启动子的第2个操纵基因OR2的序列为5'‑TAACACCGCGCGTGTTG‑3'。

A bactericidal plasmid and its construction method and Application

The present invention provides a lysozyme plasmid capable of inhibiting the expression of lysozyme gene E at 37 C and facilitating the preparation of bacterial moulting, and its construction and application in the preparation of Escherichia coli moulting. The lysozyme plasmid is characterized in that it includes temperature-sensitive regulation and its promoter gene cI857_pR, bacteriophage. The lysozyme gene E gene, rrnB terminator of pBV220 plasmid, and pUC19 plasmid vector comprise the second control gene OR2 of the thermosensitive regulation and promoter gene cI857_pR pR promoter, with a sequence of 5'TAACACCGCGCGGTGTTG_3'.

【技术实现步骤摘要】
一种溶菌质粒及其构建方法和应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种能在37℃仍能抑制溶菌基因E的表达而有利于制备菌蜕时获得更多的菌体的溶菌质粒及其构建和在制备大肠杆菌菌蜕中的应用。
技术介绍
菌蜕(Bacterialghost)是通过噬菌体PhiX174溶菌基因E的可调控表达而形成的缺少细胞浆和核酸且无繁殖能力的革兰氏阴性细菌空壳。溶菌基因E编码91个氨基酸的疏水蛋白，它能在革兰氏阴性细菌细胞膜上形成一个直径约为40～200nm的特异性的跨膜孔道，在渗透压的作用下使革兰氏阴性细菌的胞质内含物由孔道排出，从而形成不含核酸、核糖体及其他组分的细菌空壳。细菌菌蜕作为1种优良的新型疫苗正受到越来越多的关注，菌蜕使细菌表面抗原结构得以完整保留，即便是如菌毛这样脆弱的结构也能保存下来，所以菌蜕较传统疫苗保留了良好的免疫原性，可刺激机体产生更强的免疫反应，能诱导机体发生更强的体液和细胞免疫，是一种理想的新型疫苗。目前制备菌蜕主要是基于λ噬菌体启动子pL/pR及其温敏阻遏蛋白cI857的温控表达载体，在革兰氏阴性菌内对噬菌体PhiX174裂解基因E的严格表达调控来实现的。但目前该系统存在如下不足：一方面在该系统中，基因E的表达通常在28℃时受到严格抑制，而当温度高于30℃时(通常为42℃)，由于阻遏蛋白cI857的热激失活，导致基因E开始表达，进而导致细菌裂解。然而细菌在升温诱导前必须置于28℃进行培养，而28℃并非许多病原菌的最适生长温度，也不利于一些细菌表面重要抗原决定簇的保持；其次，28℃提升到42℃的温度转换会诱导细菌产生严重的热激反应进而抑制基因E介导的裂解作用；另一方面在菌蜕制备过程中，单纯基因E所介导的裂解作用并不足以使宿主菌完全灭活。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术采用了如下技术方案：本专利技术的一个目的是提供一种能在37℃仍能抑制溶菌基因E的表达的溶菌质粒，其特征在于，包括：温敏调控及其启动子基因ΔcI857-pR、噬菌体溶菌基因E基因、pBV220质粒的rrnB终止子和pUC19质粒载体组成，其中，所述温敏调控及其启动子基因ΔcI857-pR的pR启动子的第2个操纵基因OR2的序列为5'-TAACACCGCGCGTGTTG-3'。本专利技术提供的溶菌质粒，还具有这样的特征，还包括：金黄色葡萄球菌核酸酶A基因SNA基因和pBV220质粒的pL启动子，其中，所述pL启动子启动所述SNA基因的表达。本专利技术的另一个目的是提供上述的溶菌质粒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，设计含有相应酶切位点的引物克隆目的基因，根据pBV220载体系列分别设计分别用于扩增温敏调控及其启动子基因cI857-pR以及rrnB终止子的5′端加入酶切位点的2对引物对，根据噬菌体溶菌基因E基因已知序列设计用于扩增E基因的3对5′端加入酶切位点的1对引物对；步骤2，克隆并纯化回收目的基因片段，采用步骤1设计的各个引物对克隆相应基因的片段并通过相应双酶切回收纯化得到包括温敏调控及其启动子基因cI857-pR、rrnB终止子以及E基因的目的基因；步骤3，构建溶菌质粒pUC19-cI857-pR-E-rrnB，以pUC19质粒为载体，依次连接步骤2得到的目的基因cI857-pR、E和rrnB，测序正确完整的重组质粒即为质粒pUC19-cI857-pR-E-rrnB；步骤4，pUC19-cI857-pR-E-rrnB溶菌质粒的突变，以重组溶菌质粒pUC19-cI857-pR-E-rrnB为模板，通过多次扩增酶切回收得到由温敏调控及其启动子基因ΔcI857-pR、E基因以及终止子rrnB组成的片段ΔcI857-pR-E-rrnB，再将该片段与pUC19载体分别进行酶切，酶切产物回收后进行连接，得到阳性质粒测序鉴定，测序正确的重组质粒即为溶菌质粒pUC19-ΔcI857-E-rrnB，其中，温敏调控及其启动子基因cI857-pR的pR启动子的第2个操纵基因OR2的序列为5'-TAACACCGTGCGTGTTG-3'；温敏调控及其启动子基因ΔcI857-pR的pR启动子的第2个操纵基因OR2的序列为5'-TAACACCGCGCGTGTTG-3'。本专利技术提供的构建方法，还具有这样的特征：其中，步骤1中的用于扩增温敏调控及其启动子基因cI857-pR、rrnB终止子、E基因的引物对分别为引物对cI857-F和cI857-R、引物对rrnB-F和rrnB-B以及引物对E-F和E-R，各个引物的核苷酸系列从5’----3’分别为：cI857-F，AACTGCAGGACCAGAACACCTTGCCG；cI857-R，CGCGTCGACGAGATCTTTAGCTGTCTTGGTTTGC；rrnB-F，GCTCTAGACTGTTTTGGCGGATGAGAG；rrnB-R，CGCGGATCCGTAGAAACGCAAAAAGG；E-F，CGCGTCGACATGGTACGCTGGACTTTG；E-R，GCTCTAGATCACTCCTTCCGCACGT。本专利技术提供的构建方法，还具有这样的特征：其中，步骤4具体如下：步骤4.1，以cI857-pR为模板，设计引物对cI857-mutF和cI857-mutR；步骤4.2，以重组质粒pUC19-cI857-pR-E-rrnB为模板，以引物cI857-F和引物cI857-mutR为引物对扩增大小为783bp的ΔcI857-E片段，以引物cI857-mutF和引物rrnB-R为引物对扩增大小为806bp的ΔcI857-rrnB片段；步骤4.3，将步骤4.2得到的两个片段分别用胶回收试剂盒回收，以回收的ΔcI857-E片段和ΔcI857-rrnB片段同时作为模板，用引物cI857-F和引物rrnB-R为引物对扩增大小为1589bp的ΔcI857-E-rrnB片段；步骤4.4，用相应的限制性内切酶对纯化的ΔcI857-E-rrnB片段和pUC19载体进行酶切，将回收后的片段进行连接，PCR鉴定、测序，测序正确的即为溶菌质粒pUC19-ΔcI857-pR-E-rrnB，其中，引物cI857-mutF和引物cI857-mutR的核苷酸系列从5’----3’分别为：cI857-mutF，TATCTAACACCGCGCGTGTTG；cI857-mutR，CAACACGCGCGGTGTTAGATA。本专利技术提供的构建方法，还具有这样的特征，还包括：步骤5，pUC19-ΔcI857-E-rrnB-pL-SN溶菌质粒的构建，其中，步骤1中，还根据pBV220载体设计1对5′端加入酶切位点的引物对用于启动子pL的扩增，根据金黄色葡萄球菌核酸酶设计1对5′端加入酶切位点的引物对用于SNA基因的扩增；步骤2中，克隆并纯化回收得到的目的基因还包括启动子pL和SNA基因；步骤5中，将步骤2中双酶切回收得到启动子pL和SNA基因连接到步骤4得到的溶菌质粒pUC19-ΔcI857-E-rrnB上，测序正确的重组质粒即为溶菌质粒pUC19-ΔcI857-E-rrnB-pL-SN。本专利技术提供的构建方法，还具有这样的特征：其中，用于启动子pL、SNA基因扩增的引物对分别为引物对pL-F和pL-R以及引物对SN-F和SN-R，该2个引物对中的各个引本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种溶菌质粒，其特征在于，包括：温敏调控及其启动子基因ΔcI857‑pR、噬菌体溶菌基因E基因、pBV220质粒的rrnB终止子和pUC19质粒载体组成，其中，所述温敏调控及其启动子基因ΔcI857‑pR的pR启动子的第2个操纵基因OR2的序列为5'‑TAACACCGCGCGTGTTG‑3'。

【技术特征摘要】
1.一种溶菌质粒，其特征在于，包括：温敏调控及其启动子基因ΔcI857-pR、噬菌体溶菌基因E基因、pBV220质粒的rrnB终止子和pUC19质粒载体组成，其中，所述温敏调控及其启动子基因ΔcI857-pR的pR启动子的第2个操纵基因OR2的序列为5'-TAACACCGCGCGTGTTG-3'。2.根据权利要求1所述的溶菌质粒，其特征在于，还包括：金黄色葡萄球菌核酸酶A基因SNA基因和pBV220质粒的pL启动子，其中，所述pL启动子启动所述SNA基因的表达。3.权利要求1-2任意一项溶菌质粒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，设计含有相应酶切位点的引物克隆目的基因，根据pBV220载体系列分别设计分别用于扩增温敏调控及其启动子基因cI857-pR以及rrnB终止子的5′端加入酶切位点的2对引物对，根据噬菌体溶菌基因E基因已知序列设计用于扩增E基因的3对5′端加入酶切位点的1对引物对；步骤2，克隆并纯化回收目的基因片段，采用步骤1设计的各个引物对克隆相应基因的片段并通过相应双酶切回收纯化得到包括温敏调控及其启动子基因cI857-pR、rrnB终止子以及E基因的目的基因；步骤3，构建溶菌质粒pUC19-cI857-pR-E-rrnB，以pUC19质粒为载体，依次连接步骤2得到的目的基因cI857-pR、E和rrnB，测序正确完整的重组质粒即为质粒pUC19-cI857-pR-E-rrnB；步骤4，pUC19-cI857-pR-E-rrnB溶菌质粒的突变，以重组溶菌质粒pUC19-cI857-pR-E-rrnB为模板，通过多次扩增酶切回收得到由温敏调控及其启动子基因ΔcI857-pR、E基因以及终止子rrnB组成的片段ΔcI857-pR-E-rrnB，再将该片段与pUC19载体分别进行酶切，酶切产物回收后进行连接，得到阳性质粒测序鉴定，测序正确的重组质粒即为溶菌质粒pUC19-ΔcI857-E-rrnB，其中，温敏调控及其启动子基因cI857-pR的pR启动子的第2个操纵基因OR2的序列为5'-TAACACCGTGCGTGTTG-3'；温敏调控及其启动子基因ΔcI857-pR的pR启动子的第2个操纵基因OR2的序列为5'-TAACACCGCGCGTGTTG-3'。4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：其中，步骤1中的用于扩增温敏调控及其启动子基因cI857-pR、rrnB终止子、E基因的引物对分别为引物对cI857-F和cI857-R、引物对rrnB-F和rrnB-B以及引物对E-F和E-R，各个引物的核苷酸系列从5’----3’分别为：cI857-F，AACTGCAGGACCAGAACACCTTGCCG；cI857-R，CGCGTCGACGAGATCTTTAGCTGTCTTGGTTTGC；rrnB-F，GCTCTAGACTGTTTTGGCGGATGAGAG；rrn...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩先干，胡剑刚，付立霞，左佳坤，陈兆国，祁克宗，蒋蔚，龚建森，苗晋锋，米荣升，黄燕，王少辉，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所，
类型：发明
国别省市：上海,31