启动子增强系统及其在细菌中的应用技术方案

本发明专利技术公开了启动子增强系统及其在细菌中的应用。本发明专利技术公开的启动子增强系统包括CERR蛋白质编码基因与PA启动子；CERR蛋白质为氨基酸序列为序列2的蛋白质；PA启动子为序列表中序列1的第256‑548位所示的DNA分子。实验证明，本发明专利技术的启动子增强系统在不同的G+及G‑菌中，均可显著地提高下游蛋白的表达量，在乳杆菌中可以将蛋白的表达水平提高70多倍，因此该系统具有很好的应用潜力。

Promoter enhancement system and its application in bacteria

The invention discloses a promoter enhancement system and its application in bacteria. The promoter enhancement system disclosed in the invention comprises a CERR protein coding gene and a PA promoter; a CERR protein is a protein whose amino acid sequence is sequence 2; and a PA promoter is a DNA molecule shown at position 256 to 548 of sequence 1 in the sequence list. Experiments show that the promoter enhancement system of the invention can significantly increase the expression level of downstream protein in different G + and G_bacteria, and can increase the expression level of protein more than 70 times in Lactobacillus, so the system has good application potential.

【技术实现步骤摘要】
启动子增强系统及其在细菌中的应用
本专利技术涉及生物
中，启动子增强系统及其在细菌中的应用。
技术介绍
枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、乳酸菌(LacticAcidBacterial)及大肠杆菌(Escherichiacoli)是3种非常重要的原核表达宿主，是工业生产及医药领域主要的生产菌株，同时也是科学研究领域中重要的模式菌株，均具有很高的应用价值及研究价值。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)因培养简单快速，具有较强的分泌蛋白质的能力、非致病性(不含内毒素)及良好的发酵基础和生产技术，是目前生产各种工业用酶，如淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等的理想表达宿主。乳酸菌是重要的益生菌，因其被公认为是安全的(generallyregardedassafe,GRAS)食品级微生物，且不产生内毒素，自身分泌性蛋白质较少，不产生细胞外蛋白酶，不会对目的分泌蛋白进行胞外降解，因此是很具吸引力的基因工程菌。应用乳酸菌基因表达系统产生的大量酶、多肽、中间代谢物等表达产物，可以应用于食品、医药、保健业和工业等领域，有巨大的应用前景和潜在的商业价值。大肠杆菌(Escherichiacoli)是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌，其遗传背景清楚、转化和转导效率高、培养操作简单、生长繁殖快、成本低廉，可快速大规模地生产目的蛋白，且其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的30％，因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统。鉴于以上3种表达宿主的优良性状及广泛用途，建立和发展相应的基因克隆和表达系统，实现有生产价值蛋白的高产，将取得巨大的科研价值与经济利益，实现外源蛋白高效表达的关键因素之一是使用强并可控制的启动子，启动子是基因表达调控的重要顺式调控元件，也是基因工程表达载体的重要元件。依照控制转录水平的高低，启动子可以分为强启动子和弱启动子；从转录模式上分类，启动子可以分为组成型启动子、诱导型启动子、时期特异性启动子及自诱导启动子。目前发现的强启动子多为组成型启动子，组成型启动子即不需要任何诱导物，持续性表达蛋白的启动子，可用作调控元件构建表达载体实现目标蛋白的胞内或胞外大量表达。P43是革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌的组成型强启动子，但其启动下游基因转录的效率仍不高，虽然通过启动子诱捕系统(promotertrapsystem)等分子生物学手段发现了多种新型的启动子，如Plaps，是目前应用在枯草芽孢杆菌中表达的最强的组成型启动子，但此启动子的强度只是P43的13倍，应用于芽孢杆菌的强启动子系统仍有待进一步开发。乳酸菌外源蛋白表达量一般相对偏低，且乳酸菌宿主对表达载体的启动子要求比较严格，具有很高的特异性和选择性，目前可用于构建乳酸菌表达载体的启动子数量相对较少，其中大多数乳酸菌表达载体的启动子活性不高，且需要诱导，这不仅降低了外源蛋白表达的效率，也使操作变得繁琐，更重要的是限制了乳酸菌的实际应用。对于芽孢杆菌及乳酸菌，组成型启动子不需诱导等特殊条件即可在菌体存活期持续不断地表达外源基因，从而简化了操作过程、且具有相对较高的安全性，更适合在实际生产中应用，因此寻找组成型的强启动子对于芽孢杆菌及乳酸菌具有十分重要的意义。应用于大肠杆菌的启动子多为诱导型启动子，常用的T7启动子，需IPTG诱导，IPTG价格较高，在生产应用中会增加成本，而阿拉伯糖诱导的启动子，虽然成本较IPTG低，但是启动子强度也低于T7，因此如果能增强阿拉伯糖诱导的启动子，不仅降低了成本也达到了高产外源蛋白的目的。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是如何提高外源基因在生物细胞中的表达量。为解决上述技术问题，本专利技术首先提供一种启动子增强系统，所述系统包括cerR基因与PA启动子；所述cerR基因编码CERR蛋白质，所述CERR蛋白质为A1)、A2)或A3)：A1)氨基酸序列为序列2的蛋白质；A2)在序列2的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的由A1)衍生的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；所述PA启动子为下述b1)、b2)或b3)：b1)序列表中序列1的第256-548位所示的DNA分子；b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子；b3)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且具有相同功能的DNA分子。上述A2)中的蛋白质，可为与序列2所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。这里使用的术语“同一性”指与天然序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。上述应用中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5MNaPO4和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5MNaPO4和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5MNaPO4和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5MNaPO4和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次；也可为：2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；也可为：0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。上述系统中，所述cerR基因可为下述a1)、a2)或a3)：a1)序列表中序列1的第1-255位所示的DNA分子；a2)与a1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子；a3)在严格条件下与a1)或a2)限定的核苷酸序列杂交，且具有相同功能的DNA分子。上述启动子增强系统可为下述c1)、c2)或c3)：c1)序列表中序列1的第1-548位所示的DNA分子；c2)与c1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子；c3)在严格条件下与c1)或c2)限定的核苷酸序列杂交，且具有相同功能的DNA分子。本专利技术还提供了与所述系统相关的生物材料，所述生物材料为下述D1)至D6)中的任一种：D1)含有所述系统的表达盒；D2)含本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.启动子增强系统，包括cerR基因与PA启动子；所述cerR基因编码CERR蛋白质，所述CERR蛋白质为A1)、A2)或A3)：A1)氨基酸序列为序列2的蛋白质；A2)在序列2的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的由A1)衍生的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；所述PA启动子为下述b1)、b2)或b3)：b1)序列表中序列1的第256‑548位所示的DNA分子；b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子；b3)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且具有相同功能的DNA分子。

【技术特征摘要】
1.启动子增强系统，包括cerR基因与PA启动子；所述cerR基因编码CERR蛋白质，所述CERR蛋白质为A1)、A2)或A3)：A1)氨基酸序列为序列2的蛋白质；A2)在序列2的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有相同功能的由A1)衍生的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；所述PA启动子为下述b1)、b2)或b3)：b1)序列表中序列1的第256-548位所示的DNA分子；b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子；b3)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且具有相同功能的DNA分子。2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于：所述cerR基因为下述a1)、a2)或a3)：a1)序列表中序列1的第1-255位所示的DNA分子；a2)与a1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子；a3)在严格条件下与a1)或a2)限定的核苷酸序列杂交，且具有相同功能的DNA分子。3.根据权利要求1或2所述的系统，其特征在于：所述启动子增强系统为下述c1)、c2)或c3)：c1)序列表中序列1的第1-548位所示的DNA分...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟瑾，张丽，王宁，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11