一种基于荧光定量PCR技术检测鸽新城疫病毒的方法技术

本发明专利技术属于生物技术技术领域，具体涉及一种基于荧光定量PCR技术检测鸽新城疫病毒的方法。本发明专利技术所述基于荧光定量PCR技术检测鸽新城疫病毒的方法，利用荧光定量PCR技术对鸽NDV VI型进行特异性检测，而鸡新城疫强毒株和经典的LaSota疫苗毒株检测结果为阴性，为鸽NDV的临床检测提供了一种快速、准确、高通量的方法。

A method for detecting Pigeon Newcastle disease virus based on fluorescence quantitative PCR Technology

The invention belongs to the field of biotechnology, in particular to a method for detecting pigeon Newcastle disease virus based on fluorescence quantitative PCR technology. The method for detecting pigeon NDV V V based on fluorescent quantitative PCR technology is described in the invention. The method uses fluorescent quantitative PCR technology to detect the specificity of pigeon NDV V V V V V V V type, while the results of chicken NDV virulent strain and classical LaSota vaccine strain are negative, providing a rapid, accurate and high throughput method for clinical detection of pigeon NDV. .

【技术实现步骤摘要】
一种基于荧光定量PCR技术检测鸽新城疫病毒的方法
本专利技术属于生物技术
，具体涉及一种基于荧光定量PCR技术检测鸽新城疫病毒VI型的方法。
技术介绍
新城疫(Newcastledisease，ND)是由新城疫病毒(Newcastlediseasevirus，NDV)感染引起的一种高度接触性、急性败血性传染病，其宿主范围非常广泛，可以感染鸡、鸽、鹅、鹌鹑等多种禽类，是影响养禽业发展最重要的疫病之一。NDV的基因组结构为3′-NP-P-M-F-HN-L-5′，其可编码基质蛋白、融合蛋白等6种结构蛋白。研究表明，F蛋白在NDV致病过程中具有重要作用，其中，根据F蛋白裂解区域112-117位氨基酸序列差异将NDV分为强毒株、中等毒力株和弱毒株。根据F基因47-420位核苷酸的遗传进化分析，发现鸽NDV区别于其他基因型的NDV，单独处于一个分支，并将其归为基因VIb亚型。因此，鸽新城疫病毒被认为是鸡源NDV的一种变异株，但与经典的鸡源NDV相比，其在致病性上存在很大差异，它只引起鸽子发病，而对鸡的致病力非常温和。虽然当前养鸡场新城疫得到了有效预防控制，但由于缺乏防控鸽新城疫的专用疫苗，鸽新城疫仍在一些养鸽场爆发流行，给养鸽业造成了较大的经济损失。因此，能否及时、准确、快速进行确诊，对于鸽新城疫的有效控制具有重大意义。当前新城疫的诊断方法主要包括病毒分离鉴定、血凝-血凝抑制试验等经典方法和RT-PCR等分子诊断技术。但经典的检测方法则需耗费较长时间，易耽误临床诊断；更重要的是，经典的检测方法虽然能检测出NDV，但较难区分出鸡源NDV和鸽源NDV，这对于新城疫的诊断及预防都会造成一定的影响。荧光定量PCR技术(realtimefluores-cencequantitativePCR，RTFQPCR)是1996年由美国AppliedBiosystems公司推出的一种新定量试验技术，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。RT-PCR检测技术具有特异性好、灵敏度高、高通量等优点，荧光定量PCR在RT-PCR基础上通过荧光染料及探针具有更高的灵敏性和特异性，并对扩增过程进行实时监测，可直接对病料组织进行快速、准确诊断。本专利技术研究了基于荧光定量PCR技术检测鸽新城疫病毒的方法，为实际生产中尽早防控鸽新城疫病症提供一种新的技术手段。
技术实现思路
为此，本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种基于荧光定量PCR技术检测鸽新城疫病毒的方法，所述方法能更为准确的鉴定出鸽新城疫病毒。为解决上述技术问题，本专利技术所述的一种基于荧光定量PCR技术检测鸽新城疫病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)鸽新城疫病毒总RNA提取与反转录：根据鸽新城疫病毒株，设计用于进行荧光定量扩增的引物和荧光探针，并利用现有技术提取病毒总RNA，并进行反转录；(2)质粒构建：设计引物以反转录cDNA为模板扩增NDVF基因，并将所得PCR扩增产物与pMD18-T载体连接，并转化至DH5α感受态细胞中，PCR鉴定阳性质粒并送样测序，得到pMD18T-F质粒；(3)荧光定量PCR检测：以构建的pMD18T-F质粒为模板，采用一步法RT-PCR反应体系，以不同浓度的质粒为阳性标准品，绘制标准曲线；(4)样品检测：选取待检测样品，加PBS缓冲液处理并取上清，按照步骤(1)-(3)提取RNA并进行实时荧光RT-PCR检测，并结合标准曲线测定待测样品。所述步骤(1)中，所述用于进行荧光定量扩增的引物包括：上游引物(pF1)：5'-CAGAGAGTAATGGCAAAC-3'；下游引物(pR1)：5'-ACGGTTAGAGCGATATAG-3'。所述步骤(1)中，所述荧光探针(probe)的序列为：5'FAM-TCGGACTAATCAACACATCTGCTCT-TEMRA3'。所述步骤(1)中，所述提取病毒总RNA的步骤包括：取接种鸽新城疫病毒的尿囊液0.2mL，加入1mLTrizol，使其充分混匀后静置，并加入0.2mL氯仿，振荡后室温静置，离心取上清水相，转移至新的EP管中，加入等体积的预冷异丙醇，室温静置闭关离心弃上清，向沉淀中加入1mL70％预冷的乙醇洗涤RNA沉淀，离心并室温干燥，并加入14μLDEPC水RNA充分溶解，即得。所述步骤(1)中，所述反转录步骤中，所述反转录体系包括：dNTPs2.5mM、反转录酶M-MLV、5×反转录酶缓冲液，以及RNA抑制剂。所述步骤(2)中，所述扩增NDVF基因步骤中，所用引物包括：上游引物(pF3)：5'-CAggATgggCTCCAgACCTT-3'；下游引物(pR1)：5'-ACCTTCgTTCCTCATCTgTgTT-3'。所述步骤(3)中，所述RT-PCR反应体系包括：2×OneStepRT-PCRBufferⅢ10μL；TaKaRaExTaqHS(5U/μl)0.4μl；PrimeScriptRTEnzymeMixⅡ0.4μl；模板2μL(50ng)；Probe0.3uL；正链引物0.4μL；负链引物0.4μL；补加ddH2O至20μL。所述步骤(3)中，所述荧光PCR测定步骤中，循环参数为：经95℃10s、60℃15s、95℃20s共40个循环分析熔解曲线。所述步骤(3)中，所述PCR扩增反应的退火温度为58℃。本专利技术还公开了所述基于荧光定量PCR技术检测鸽新城疫病毒的方法在鸽新城疫病毒检测领域中的应用。本专利技术所述基于荧光定量PCR技术检测鸽新城疫病毒的方法，利用荧光定量PCR技术对鸽NDVVI型进行特异性检测，而鸡新城疫强毒株和经典的LaSota疫苗毒株检测结果为阴性，可有效避免其他新城疫病毒的影响，为鸽NDV的临床检测提供了一种快速、准确、高通量的方法。本专利技术所述方法的检测极限达0.1EID50鸽新城疫病毒，比传统RT-PCR方法提高100倍，可一步完成荧光定量PCR检测，可大大提高检测速度和检测周期。附图说明为了使本专利技术的内容更容易被清楚的理解，下面根据本专利技术的具体实施例并结合附图，对本专利技术作进一步详细的说明，其中，图1是鸽新城疫病毒F基因的PCR扩增结果；其中M泳道为DNAmarkerDL2000、第1泳道为F基因；图2是pMD18T-F质粒标准曲线建立结果；图3是是荧光定量PCR特异性检测结果，其中1泳道为鸡NDV强毒CN1204，2泳道为鸡NDV弱毒LaSota，3泳道为鸡NDV强毒I系毒，4泳道为鸽NDVYCE3株，5泳道为鸽NDVCQE3株，6泳道为鸽NDVLCE4株，7泳道为阴性对照；图4为RT-PCR特异性检测结果，其中M泳道为DNAmarkerDL2000，第1泳道为鸡NDV强毒CN1204，第2泳道为鸡NDV弱毒LaSota，第3泳道为鸡NDV强毒I系毒，第4泳道为鸽NDVYCE3株，第5泳道为鸽NDVCQE3株，第6泳道为鸽NDVLCE4株，第7泳道为阴性对照；图5是荧光定量PCR敏感性检测结果，其中，1为104EID50/0.1mL，2为103EID50/0.1mL，3为102EID50/0.1mL，4为101EID50/0.1mL，5为100EID50/0.1mL，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于荧光定量PCR技术检测鸽新城疫病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)鸽新城疫病毒总RNA提取与反转录：根据鸽新城疫病毒株，设计用于进行荧光定量扩增的引物和荧光探针，并利用现有技术提取病毒总RNA，并进行反转录；(2)质粒构建：设计引物以反转录cDNA为模板扩增NDV F基因，并将所得PCR扩增产物与pMD18‑T载体连接，并转化至DH5α感受态细胞中，PCR鉴定阳性质粒并送样测序，得到pMD18T‑F质粒；(3)荧光定量PCR检测：以构建的pMD18T‑F质粒为模板，采用一步法RT‑PCR反应体系，以不同浓度的质粒为阳性标准品，绘制标准曲线；(4)样品检测：选取待检测样品，加PBS缓冲液处理并取上清，按照步骤(1)‑(3)提取RNA并进行实时荧光RT‑PCR检测，并结合标准曲线测定待测样品。

【技术特征摘要】
1.一种基于荧光定量PCR技术检测鸽新城疫病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)鸽新城疫病毒总RNA提取与反转录：根据鸽新城疫病毒株，设计用于进行荧光定量扩增的引物和荧光探针，并利用现有技术提取病毒总RNA，并进行反转录；(2)质粒构建：设计引物以反转录cDNA为模板扩增NDVF基因，并将所得PCR扩增产物与pMD18-T载体连接，并转化至DH5α感受态细胞中，PCR鉴定阳性质粒并送样测序，得到pMD18T-F质粒；(3)荧光定量PCR检测：以构建的pMD18T-F质粒为模板，采用一步法RT-PCR反应体系，以不同浓度的质粒为阳性标准品，绘制标准曲线；(4)样品检测：选取待检测样品，加PBS缓冲液处理并取上清，按照步骤(1)-(3)提取RNA并进行实时荧光RT-PCR检测，并结合标准曲线测定待测样品。2.根据权利要求1所述基于荧光定量PCR技术检测鸽新城疫病毒的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述用于进行荧光定量扩增的引物包括：上游引物(pF1)：5'-CAGAGAGTAATGGCAAAC-3'；下游引物(pR1)：5'-ACGGTTAGAGCGATATAG-3'。3.根据权利要求1所述基于荧光定量PCR技术检测鸽新城疫病毒的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述荧光探针(probe)的序列为：5'FAM-TCGGACTAATCAACACATCTGCTCT-TEMRA3'。4.根据权利要求1-3任一项所述基于荧光定量PCR技术检测鸽新城疫病毒的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述提取病毒总RNA的步骤包括：取接种鸽新城疫病毒的尿囊液0.2mL，加入1mLTrizol，使其充分混匀后静置，并加入0.2mL氯仿，振荡后室温静置，离心取上清水相，转移至新的EP管中，加入等体积的预冷异丙...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘存霞，党安坤，孙圣福，胡峰，于可响，张月，兰邹然，
申请(专利权)人：山东省农业科学院家禽研究所，山东省动物疫病预防与控制中心，
类型：发明
国别省市：山东,37