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一种刺螫库蠓的特异DNA序列及其分子鉴定方法技术

技术编号:18845090 阅读:4 留言:0更新日期:2018-09-05 09:10
本发明专利技术公开一种刺螫库蠓的特异DNA序列及其分子鉴定方法,其特征在于采用分子生物学DNA测序的方法获取该库蠓的Cytb基因序列,再通过基因序列相似性比对,从而根据比对结果对该库蠓进行种类鉴定。本发明专利技术提供的刺螫库蠓分子鉴定方法,有利于实现刺螫库蠓快速、准确的鉴定。

A specific DNA sequence and molecular identification method of midge

The invention discloses a specific DNA sequence of Culicoides spinosus and a molecular identification method thereof, which is characterized in that the Cytb gene sequence of the Culicoides spinosus is obtained by using the method of molecular biological DNA sequencing, and then the similarity of the gene sequence is compared, so as to identify the species of the Culicoides according to the alignment results. The molecular identification method of Culicoides spinosus provided by the invention is beneficial to the rapid and accurate identification of Culicoides spinosus.

【技术实现步骤摘要】
一种刺螫库蠓的特异DNA序列及其分子鉴定方法
本专利技术涉及昆虫物种鉴定领域,具体涉及刺螫库蠓的特异DNA序列及其分子鉴定方法。
技术介绍
刺螫库蠓(CulicoidespunctatusMeigen,1804)隶属于昆虫纲(Insecta)双翅目(diptera)蠓科(Ceratopogonidae)库蠓属(CulicoidesLatreille,1809),其体型微小,在世界范围内广泛分布。刺螫库蠓是一种吸血蠓,可刺吸人和动物血液带来直接骚扰,也可携带病原体进而传播人畜疾病,如蓝舌病病毒(BTV)等。由于蓝舌病等一旦爆发流行将带来巨大的经济损失,而对吸血蠓的研究有助于切断虫媒疾病的传播途径,故其在医学与兽医学领域具有重要的研究意义。因此,准确鉴定疾病媒介是对蠓传疾病进行监测、防治的关键一步。由于蠓虫体型微小、形态特征稀少等原因,传统形态学分类鉴定存在以下不足:(1)卵、幼虫和蛹等早期发育阶段的形态结构和肢体残缺的虫体均难以辩认;(2)传统形态学鉴定的操作过程较为繁琐且需具备较强的专业知识和丰富是实践经验;(3)受限于库蠓性别,如雄性非吸血蠓通过外生殖器和尾器等形态特征易于鉴别,而雌性吸血蠓却难以鉴别;(4)库蠓表型的可塑性和遗传的可变性等也容易导致误判。因此,亟需寻求一种快速、稳定的方法,以实现蠓虫如刺螫库蠓等媒介的准确鉴定。随着分子生物学和生物信息学的快速发展,以DNA序列分析为依据的分子鉴定已成为物种鉴定的常用技术手段,极大地弥补了传统分类学鉴定的不足。一般来说,昆虫的DNA分子标记会选择一段标准的、有足够变异和一定保守性的、且相对较短易扩增的DNA片段。因此,昆虫的线粒体DNA包含多个基因如ND1-6、ND4L、COI-COIII、ATPase6、ATPase8、Cytb等,非常适合作为分子鉴定的分子标记。目前,应用较多的分子标记是COI、COII、Cytb、12SrRNA、16SrRNA、ND4、ND5等。12SrRNA和16SrRNA因其存在大量的插入和缺失现象,且基因高度保守,进化较慢,故不宜用做条形编码基因。ND4和ND5进化太快,难以设计出通用引物,限制了它们作为全面DNA鉴定系统的目标基因。Cytb基因大小和结构较为保守,包含信息量大,能够保证足够变异的同时又容易被通用引物扩增,在物种内不同个体之间的差异应小于2%,而近缘种间的差异远大于同种不同个体间,是使用较为广泛的分子标记。迄今为止,已有诸多研究证明Cytb基因适用于昆虫、鸟类、鱼类、哺乳类等类群的分类鉴定。因此,可采用基于Cytb基因的特异DNA序列对吸血蠓进行分子鉴定。该方法与传统形态学分类方法互为佐证,不仅可实现吸血蠓的快速、准确鉴定,而且可帮助发现库蠓属中的隐存种或新种。目前,通过该方法已获得多种吸血蠓的Cytb基因序列并上传至GenBank中,但至今尚无刺螫库蠓的Cytb基因序列。本专利技术提供刺螫库蠓的特异DNA序列有利于实现其快速、准确鉴定,缩短物种鉴定周期。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种刺螫库蠓的特异DNA序列及其分子鉴定方法。通过分子生物学DNA测序的方法获取刺螫库蠓的特异DNA序列—Cytb基因序列,通过基因序列相似性的比对,实现刺螫库蠓的快速、准确鉴定。为实现上述目的,本专利技术通过如下技术方案实现:通过DNA模板制备和PCR反应,由合成的引物扩增刺螫库蠓的Cytb基因,经扩增后PCR产物可用琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果,并将特异性扩增出大小约为500bp的条带序列送生物公司测序。测序结果通过手工校对、序列拼接,并在NCBI中进行Blast相似性搜索,确保所得序列为目标基因序列,同时刺螫库蠓的种类鉴定依靠形态学鉴定所实现,并经权威专家复核,从而保证了结果的可靠性。本专利技术所述的刺螫库蠓的特异DNA序列为Cytb基因序列,所述刺螫库蠓的Cytb基因序列如SEQIDNo.1所示:tactttttattcgcttatgctattcttcgatctatccccaataaattaggaggagtaatt60gccttagtcatatcaattgcaattctttttattttaccttttacccacaaaagaaacttt120cgaactttaaaattctacccattaaataaaattttattttgaaacttttttattatcgta180ctattactaacttgaattggagcccgacctgtagaagacccgtatattttaaccggacaa240attttaacagttttatattttttctactacttattaaatccccttactataaaaatatga300gataaaataatttattaatcaatgagcttgaataagcatatgttttgaaaacataagata360aaataatttttattgatttttactaaaaattaatcatataattaaaataaaaattaataa420tttaagactaacaaataaaattaaaaaacataaagaaaaagataaataactttttcaagc480taagtatattaatttatcat500所述的刺螫库蠓的特异DNA序列的PCR引物分别为:正向引物:5’CAYATTCAACCWGAATGATA3’。反向引物:5’GGTAYWTTGCCTCGAWTTCGWTATGA3’。本专利技术的刺螫库蠓的分子鉴定方法,步骤包括:1)从待测的蠓组织中分离提取DNA;2)以该DNA为模板,采用的引物为:正向引物:5’CAYATTCAACCWGAATGATA3’,反向引物:5’GGTAYWTTGCCTCGAWTTCGWTATGA3’,通过聚合酶链式反应扩增出刺螫库蠓Cytb基因;3)然后取适量步骤2)的聚合酶链式反应产物用琼脂糖凝胶电泳分离,根据电泳条带判断是否为目的条带,如果能特异性扩增出大小约为500bp的条带,则将PCR产物切胶纯化,-20℃保存;4)聚合酶链式反应扩增出该库蠓Cytb基因与pEASY-T1载体连接转化进Trans1-T1感受态细胞中进行克隆,根据蓝白斑筛选出阳性克隆后扩增,再将含阳性克隆的菌液用60%甘油保存送至生物公司进行双向测序;5)通过测序结果的比对分析,如果相应Cytb基因序列与SEQIDNo.1的相似性在98%以上,即可判断所述的待测组织为刺螫库蠓。采用上述技术方案的有益效果是:1)本专利技术联合了传统的形态学鉴定与分子鉴定方法,对所述库蠓进行鉴定,可确保物种鉴定的准确性和可靠性。2)本专利技术与传统的形态学鉴定方法相比,所建立的刺螫库蠓分子鉴定方法可大大缩短刺螫库蠓的鉴定时间。3)本专利技术填补了刺螫库蠓Cytb基因序列在GenBank数据库中的空白。附图说明图1为本专利技术的技术流程图。图2为刺螫库蠓Cytb基因PCR扩增结果的电泳图谱。编号说明如下:泳道1-3为刺螫库蠓雌虫的Cytb基因,检出大小约为500bp的条带。M为250bpDNALadderMarker。图3为未知库蠓雌虫Cytb基因PCR扩增结果的电泳图谱。编号说明如下:泳道1未知库蠓雌虫的Cytb基因,检出大小约为500bp的条带。M为250bpDNALadderMarker。具体实施方式实施例1刺螫库蠓Cytb基因序列本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种刺螫库蠓的特异DNA序列,其特征在于,所述的特异DNA序列为Cytb基因,为如下所述的基因序列SEQ ID No .1:tactttttat tcgcttatgc tattcttcga tctatcccca ataaattagg aggagtaatt  60gccttagtca tatcaattgc aattcttttt attttacctt ttacccacaa aagaaacttt  120cgaactttaa aattctaccc attaaataaa attttatttt gaaacttttt tattatcgta  180ctattactaa cttgaattgg agcccgacct gtagaagacc cgtatatttt aaccggacaa  240attttaacag ttttatattt tttctactac ttattaaatc cccttactat aaaaatatga  300gataaaataa tttattaatc aatgagcttg aataagcata tgttttgaaa acataagata  360aaataatttt tattgatttt tactaaaaat taatcatata attaaaataa aaattaataa  420tttaagacta acaaataaaa ttaaaaaaca taaagaaaaa gataaataac tttttcaagc  480taagtatatt aatttatcat                                              500。...

【技术特征摘要】
1.一种刺螫库蠓的特异DNA序列,其特征在于,所述的特异DNA序列为Cytb基因,为如下所述的基因序列SEQIDNo.1:tactttttattcgcttatgctattcttcgatctatccccaataaattaggaggagtaatt60gccttagtcatatcaattgcaattctttttattttaccttttacccacaaaagaaacttt120cgaactttaaaattctacccattaaataaaattttattttgaaacttttttattatcgta180ctattactaacttgaattggagcccgacctgtagaagacccgtatattttaaccggacaa240attttaacagttttatattttttctactacttattaaatccccttactataaaaatatga300gataaaataatttattaatcaatgagcttgaataagcatatgttttgaaaacataagata360aaataatttttattgatttttactaaaaattaatcatataattaaaataaaaattaataa420tttaagactaacaaataaaattaaaaaacataaagaaaaagataaata...

【专利技术属性】
技术研发人员:侯晓晖岑常活韩晓静
申请(专利权)人:遵义医学院
类型:发明
国别省市:贵州,52

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