胃癌干细胞冻存液及冻存方法技术

本发明专利技术涉及干细胞技术领域，尤其涉及胃癌干细胞冻存液及冻存方法。本发明专利技术提供了一种由冷冻保护剂和DMEM/F12培养基组成的胃癌干细胞冻存液及胃癌干细胞的冻存方法，本发明专利技术提供规定培养液成分简单，不含有血清，且能够实现对胃癌干细胞的稳定保存。本发明专利技术提供的方法简单易行，无需复杂仪器。实验表明，复苏后的GCSCs成团生长，大小、形态及数量与新分选的GCSCs比较无明显差别，CD44的表达也一样，说明成功获得用于冻存CD44(+)胃癌干细胞的有效冻存液。与新分选的GCSCs相比，冻存1个月、3个月及6个月后复苏的细胞中β‑actin表达量差异不明显。表明复苏的GCSCs状态好，可用于后续实验。

Cryopreservation of gastric cancer stem cells and cryopreservation methods

The invention relates to the field of stem cell technology, in particular to gastric cancer stem cell cryopreservation solution and cryopreservation method. The invention provides a method for cryopreservation of gastric cancer stem cells and gastric cancer stem cells composed of cryoprotectant and DMEM/F12 medium. The prescribed culture medium is simple in composition, does not contain serum, and can realize stable preservation of gastric cancer stem cells. The method provided by the invention is simple and feasible without complicated instruments. Experiments showed that the resuscitated GCSCs grew in clumps. There was no significant difference in size, shape and quantity between the resuscitated GCSCs and the newly selected GCSCs, and the expression of CD44 was the same. This indicated that the effective cryopreservation solution for CD44 (+) gastric cancer stem cells was successfully obtained. Compared with the newly selected GCSCs, there was no significant difference in the expression of beta-actin in the recovered cells frozen for 1 month, 3 months and 6 months. It indicates that the resuscitation of GCSCs is good and can be used for subsequent experiments.

【技术实现步骤摘要】
胃癌干细胞冻存液及冻存方法
本专利技术涉及干细胞
，尤其涉及胃癌干细胞冻存液及冻存方法。
技术介绍
胃癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，其死亡率仅次于肺癌。肿瘤干细胞(cancerstemcells)是肿瘤基础研究领域的热点和难点问题。现代研究认为，肿瘤干细胞是肿瘤中具有自我更新特性和分化为不同肿瘤细胞能力的一种细胞，被认为参与了肿瘤的发生、维持和进展等诸多过程。存在于胃癌中的胃癌干细胞(gastriccancerstemcells，GCSCs)，在胃癌发生发展中发挥重要作用，它们是化疗耐受的基础，并常常导致肿瘤快速生长和转移。因此，目前对GCSCs的研究越来越受到关注，然而在对GCSCs的研究过程中，其保存方法尚未得到解决，GCSCs难以保存，每次实验时都需要分选，对后续实验造成了很大的负担，增加了许多的工作量。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供胃癌干细胞冻存液及冻存方法，该冻存液能够实现对GCSCs的良好冻存，并且复苏后观察细胞形态、肿瘤成球时间及转染后细胞蛋白表达情况的差异。本专利技术提供的胃癌干细胞冻存液，由冷冻保护剂和DMEM/F12培养基组成；所述冷冻保护剂为DMSO或甘油。在本专利技术实施例中，冷冻保护剂与DMEM/F12培养基的体积比为3:(6～8)。在一些实施例中，冷冻保护剂与DMEM/F12培养基的体积比为3:7。在一些实施例中，所述冷冻保护剂为DMSO。所述DMEM/F12培养基为DMEM/F12(1:1)培养基。本专利技术提供的冻存液的主要成分为细胞培养液成分，而不采用血清，在保证了营养的前提下，避免了异源血清带来的风险。该冻存液对胃癌干细胞冻存至少可达6个月，且复苏后细胞β-actin的表达表达量无明显差异，成团生长，大小、形态及数量与新分选的GCSCs比较无明显差别，可用于后续研究。且，由于避免了血清的使用，该冻存液的成本大大降低。本专利技术还提供了胃癌干细胞的冻存方法，将胃癌干细胞以所述的胃癌干细胞冻存液重悬，0～4℃放置15min～60min；再-15℃～-25℃放置30～60min，然后不高于-80℃冻存。所述重悬后，4℃放置30min；再-20℃放置45min，然后-80℃冻存或置于液氮中冻存。本专利技术实施例中，所述重悬至胃癌干细胞的密度为1×106cell/ml。本专利技术实施例中，所述胃癌干细胞为对数期的胃癌干细胞。本专利技术实施例中，所述胃癌干细胞由胃癌细胞经磁珠分选制得。一些具体实施例中，所述胃癌干细胞的制备方法包括：将胃癌细胞以含有10％FBS的RPMI-1640培养基培养至对数期后，制成单个细胞；将所述单个细胞经CD44抗体磁珠筛选后用SFM培养基，培养至融合度为80％。本专利技术实施例中，胃癌细胞为SGC7901细胞。本专利技术首先通过免疫磁珠细胞分选(Magneticcellsorting，MACS)技术分选SGC7901干细胞(即胃癌干细胞，GCSCs)，并对其进行培养，然后用免疫荧光检测SGC7901细胞分选前后CD44的表达情况，证实分选细胞为GCSCs。待细胞培养至一定数量后对其进行冻存、复苏等发现，GCSCs也能像其他干细胞一样进行冻存保种，用于后续实验研究，极大地减少了科研工作量。本专利技术提供了一种由冷冻保护剂B和DMEM/F12培养基组成的胃癌干细胞冻存液及胃癌干细胞的冻存方法，本专利技术提供规定培养液成分简单，不含有血清，且能够实现对胃癌干细胞的稳定保存。本专利技术提供的方法简单易行，无需复杂仪器。实验表明，复苏后的GCSCs成团生长，大小、形态及数量与新分选的GCSCs比较无明显差别，CD44的表达也一样，说明成功获得用于冻存CD44(+)胃癌干细胞的有效冻存液。与新分选的GCSCs相比，冻存1个月、3个月及6个月后复苏的细胞中β-actin表达量差异不明显。表明复苏的GCSCs状态好，可用于后续实验。附图说明图1示免疫荧光检测分选前后SGC7901细胞膜CD44的表达情况；其中，图1-a示未分选SGC7901细胞(×20)的细胞膜CD44的表达情况；图1-b示CD44(-)SGC7901细胞(×20)的细胞膜CD44的表达情况；图1-c示CD44(+)SGC7901细胞(×20)的细胞膜CD44的表达情况；图2示免疫荧光检测冻存1冻存GCSCs细胞CD44的表达情况；其中，图2-a示新分选GCSCs形态(×4)；图2-b示新分选GCSCs的CD44表达(×20)；图2-c示以冻存液1冻存1个月后复苏GCSCs形态(×4)；图2-d示以冻存液1冻存1个月后复苏GCSCs的CD44表达(×20)；图2-e示以冻存液1冻存3个月后复苏GCSCs形态(×4)；图2-f示以冻存液1冻存3个月后复苏GCSCs的CD44表达(×20)；图2-g示以冻存液1冻存6个月后复苏GCSCs形态(×4)；图2-h示以冻存液1冻存6个月后复苏GCSCs的CD44表达(×20)；图3示免疫荧光检测冻存2冻存GCSCs细胞CD44的表达情况；图3-a示新分选GCSCs形态(×4)；图3-b示新分选GCSCs的CD44表达(×20)；图3-c示以冻存液2冻存1个月后复苏GCSCs形态(×4)；图3-d示以冻存液2冻存1个月后复苏GCSCs的CD44表达(×20)；图3-e示以冻存液2冻存3个月后复苏GCSCs形态(×4)；图3-f示以冻存液2冻存3个月后复苏GCSCs的CD44表达(×20)；图3-g示以冻存液2冻存6个月后复苏GCSCs形态(×4)；图3-h示以冻存液2冻存6个月后复苏GCSCs的CD44表达(×20)；图4示免疫荧光检测冻存液3冻存GCSCs细胞CD44的表达情况；图4-a示新分选GCSCs形态(×4)；图4-b示新分选GCSCs的CD44表达(×20)；图4-c示以冻存液3冻存1个月后复苏GCSCs形态(×4)；图4-d示以冻存液3冻存1个月后复苏GCSCs的CD44表达(×20)；图4-e示以冻存液3冻存3个月后复苏GCSCs形态(×4)；图4-f示以冻存液3冻存3个月后复苏GCSCs的CD44表达(×20)；图4-g示以冻存液3冻存6个月后复苏GCSCs形态(×4)；图4-h示以冻存液3冻存6个月后复苏GCSCs的CD44表达(×20)；图5示Westernblot检测β-actin蛋白的表达；图5-a、5-b、图5-c分别为冻存液1组、冻存液2组、冻存液3组的westernblot检测的β-actin蛋白条带图及β-actin蛋白的表达量扫描灰度值；其中，A示新分选GCSCs；B示冻存1个月后复苏GCSCs；C示冻存3个月后复苏GCSCs；D示冻存6个月后复苏GCSCs。具体实施方式本专利技术提供了胃癌干细胞冻存液及冻存方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。本专利技术采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。其中：人胃癌SGC7901细胞与市场购得。RPMI-1640培养基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种胃癌干细胞冻存液，其特征在于，由冷冻保护剂和DMEM/F12培养基组成；所述冷冻保护剂为DMSO或甘油。

【技术特征摘要】
1.一种胃癌干细胞冻存液，其特征在于，由冷冻保护剂和DMEM/F12培养基组成；所述冷冻保护剂为DMSO或甘油。2.根据权利要求1所述的胃癌干细胞冻存液，其特征在于，所述冷冻保护剂与DMEM/F12培养基的体积比为3:(6～8)。3.根据权利要求1所述的胃癌干细胞冻存液，其特征在于，所述冷冻保护剂与DMEM/F12培养基的体积比为3:7。4.根据权利要求1～3任一项所述的胃癌干细胞冻存液，其特征在于，所述冷冻保护剂为DMSO。5.一种胃癌干细胞的冻存方法，其特征在于，将胃癌干细胞以权利要求1～4任一项所述的胃癌干细胞冻存液重悬，0～4℃放置15min～60min...

【专利技术属性】
技术研发人员：凌晖，蔡志宏，曾铁兵，曹怡静，骆奕辰，
申请(专利权)人：南华大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43