电化学测定方法、电化学测定装置以及传感器制造方法及图纸

一种电化学测定方法，通过电化学方式测定溶液中的生物样品所生成或消耗的化学物质，作为已知条件包含与化学物质发生电子的转移而使氧化还原反应进行的工作电极的电极面尺寸和生物样品的尺寸，以生物样品与电极面的沿着相对于电极面垂直的方向距离为变量，基于在生物样品中生成或消耗化学物质的化学反应的速度、溶液中的化学物质的浓度分布的变化、电极面上的与化学物质发生电子转移的速度而进行计算出在工作电极中流通的电流的模拟，求出包括电流达到最大值的点在内、电流达到最大值的90％以上的大小的垂直方向距离的范围，在溶液中使生物样品与电极面在相对于电极面垂直的方向上分开属于所述范围的距离而进行测定。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】电化学测定方法、电化学测定装置以及传感器
该专利技术涉及通过电化学方式测定细胞和细胞团、组织片等其他生物样品以及包含生物相关物质的非生物样品(以下，在本申请中一并简称为“生物样品”)所生成或消耗的化学物质的电化学测定方法、电化学测定装置以及在电化学测定中使用的传感器。
技术介绍
对在细胞中生成或消耗的化学物质进行定量评价的技术的构筑不仅有助于基础生化学的发展，也对在癌症诊查等中使用的细胞诊断，在再生医疗、免疫细胞治疗等中使用的移植用细胞的品质评价、药效评价和毒性评价中作为动物实验的替代品应用等医疗和生命科学领域的发展有着极大贡献。然而，细胞的生理活性不仅随着温度、pH、培养基成分、相邻的细胞、细胞外基质等细胞所处的环境而变化，也会根据基因转移、药物曝露、应力施加等外部刺激和细胞分裂、细胞死亡等细胞活动而经时变化。因此，为了对在生物体内实际工作的细胞的真正性质进行评价，重要的是将作为样本的细胞设置在与保持活性(保持细胞生理活性)的生物体内尽可能接近的环境，进而相对于外部刺激和细胞活动，对该细胞生成或消耗的化学物质进行实时测定。作为将样品即细胞设置在接近生物体内的环境的一种方法，通常不选择单一细胞作为样品，而是选择多个细胞和细胞外基质(extracellularmatrix：ECM)成分的凝集体即细胞团(球状体)作为样品。这是由于细胞所表示的各种生理活性中大多会与所接触的相邻细胞或ECM进行相互作用，因此认为它们的凝集体即细胞团更能忠实地再现生物体内的环境。作为这样的细胞团，能够举出例如由胰腺提取的胰岛细胞、受精卵、通过细胞培养而得到的肝细胞和神经细胞球状体、ES(embryonicstem；胚胎干)细胞的胚状体等。这些细胞团的直径根据构成细胞的种类、生物体内的提取部位、培养条件等而不同，但在用于细胞活性的评价的情况下大多使用直径在100－600μm左右的细胞团。这是由于，在直径100μm以下的小的细胞团中构成细胞数过少而难以显现细胞团特有的生理活性，并且在直径为600μm以上的大的细胞团中，氧难以扩散到细胞团中心部的细胞，细胞容易坏死。作为对在细胞中生成或消耗的化学物质进行实时测定的一种方法，使用电化学方法。在该电化学方法中，需要与样品设置在同一溶液内并且用于检测样品的各种电化学信号的电极(工作电极)。在这里，由于该工作电极的电位控制或电流控制的差异，存在各种检测方法。在与细胞等的代谢活性有关的测定中，出于比较性的高低、解析的容易性，一直以来使用以计时安培分析法和循环伏安法为代表的控制电位电解法(定电位电解法)。在该控制电位电解法中，以时间函数对工作电极的电位进行控制，此时，检测在工作电极产生的电流值。在一般的细胞团中生成或消耗的化学物质的电化学测定中，伴随着细胞团的物质代谢，组成在细胞团内或细胞团表面生成具有氧化还原活性的化学物质的反应系统，它们在工作电极上发生氧化或还原而产生电流。在伴随着细胞的物质代谢而生成具有氧化还原活性的化学物质的反应系统中，通过所关注的代谢系统而能够设计出各种系统，其中在以高灵敏度检测极微量的代谢物质为目的的情况下，优选使用利用酶促反应的系统。例如，在由鼠ES细胞制成的细胞团即胚状体中，存在于细胞表面的酶即碱性磷酸酶(ALP)的量随着分化状态而增减。于是，以评价胚状体的分化状态为目的，屡次进行ALP生成量的电化学的评价(非专利文献1)。在该评价系统中，通过将胚状体放置于基质即对－氨基苯丙酮(PAPP)所溶解的溶液中，通过ALP酶活性使PAPP的脱磷反应进行，结果生成具有氧化还原活性的对－氨基苯酚(PAP)。如果溶液中的PAPP浓度充分高，即使细胞所生成的ALP量是极微量，通过该酶的活性也能够使具有氧化还原活性的化学物质即PAP的量随着时间累积，因此最终能够高精度地检测ALP存在量。现有技术文献非专利文献非专利文献1：M.Sen,etal.,“BiosensorsandBioelectronics”2013年，48卷，p.12－18
技术实现思路
专利技术所要解决的技术问题然而，在细胞中生成或消耗的具有氧化还原活性的化学物质只要不受到来自外部的特别的水力学的作用，就会由于扩散作用而以细胞为中心在溶液中呈放射状扩散，其一部分到达工作电极而氧化或还原。因此，此时产生的电流量很大程度上受到化学物质生成或消耗量以及化学物质到工作电极的扩散距离的影响。然而，在基板上形成工作电极的情况下，如果使样品接近工作电极，则样品与基板的间隔变小，样品向溶液中所溶解的基质的供给受阻，因此通过酶促反应而由样品生成的化学物质的量比样品远离基板而在溶液中浮游的情况要低。并且，由于样品与工作电极之间的空间体积小，因此所生成的化学物质的大部分不能在该空间内滞留而向远方逸散。由于逸散的化学物质到工作电极的距离变长，其结果是，到达工作电极的量减少、灵敏度降低(问题点1)。另外，由于样品表面凹凸的影响和样品形状不一定是球形，工作电极与样品之间的垂直方向距离的控制精度存在极限。一般来说，该垂直方向距离在每次测定时至少以数μm程度波动，由此化学物质的扩散距离不是一定的，测定的比较性、再现性低下(问题点2)。在非专利文献1中，通过基板上的工作电极来测定化学物质的量，具有上述问题点1、2。另一方面，也存在使用探针状的工作电极(探针电极)而非基板上的工作电极的情况。一般来说，与样品相比，探针电极的前端极为微细，探针电极进而其支撑体对样品向溶液中的溶质的供给阻碍与基板上的电极的情况相比要小。因此，上述问题点1不会成为大的问题。并且，一般来说，探针电极相对于样品的位置能够通过计算机以μm的指令进行精细控制。因此，上述问题点2也不会成为问题。然而，在探针电极的位置控制中，需要机械手、用于观测探针前端位置的显微镜系统等昂贵的设备。另外，如果是缺乏经验的使用者，则探针电极经常会破损。该专利技术的目的在于提供一种电化学测定方法、电化学测定装置以及在电化学测定中使用的传感器，在不使用探针电极作为工作电极、而是使用例如在基板上形成而固定配置在溶液中的工作电极的电化学测定中，与以往相比能够使灵敏度、比较性以及再现性提高。用于解决技术问题的技术方案根据该专利技术第一观点的电化学测定方法，通过电化学方式对溶液中的生物样品生成或消耗的化学物质进行测定的电化学测定方法，作为已知条件包含与化学物质发生电子的转移而使氧化还原反应进行的工作电极的电极面的尺寸和生物样品的尺寸，以生物样品与电极面的相对于电极面垂直的方向的距离为变量，基于在生物样品中生成或消耗化学物质的化学反应的速度、溶液中的化学物质的浓度分布的变化和电极面上的与化学物质发生电子的转移的速度，进行计算出在工作电极中流通的电流的模拟，求出包含电流达到最大值的点在内、电流达到最大值的90％以上的大的垂直方向距离的范围，在溶液中使生物样品与电极面在相对于电极面垂直的方向上分开属于所述范围的距离而进行测定。根据该专利技术第二观点的电化学测定方法，使用具备与化学物质发生电子的转移而使氧化还原反应进行且具有80μm以下的径尺寸del的电极面的工作电极通过电化学方式测定溶液中的、具有100μm以上600μm以下的径尺寸的生物样品生成或消耗的化学物质，在该电化学测定方法中，在溶液中设置隔片，所述隔片具有相对于电极面的垂直本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种电化学测定方法，通过电化学方式测定溶液中的生物样品所生成或消耗的化学物质，该电化学测定方法的特征在于，作为已知条件包含与所述化学物质发生电子的转移而使氧化还原反应进行的工作电极的电极面的尺寸和所述生物样品的尺寸，以所述生物样品与所述电极面的相对于所述电极面垂直的方向的距离为变量，基于在所述生物样品中生成或消耗所述化学物质的化学反应的速度、所述溶液中的所述化学物质的浓度分布的变化和所述电极面上的与所述化学物质发生电子的转移的速度，进行计算出在所述工作电极中流通的电流的模拟，求出包含所述电流达到最大值的点在内、所述电流达到所述最大值的90％以上的大小的所述垂直方向距离的范围，在所述溶液中使所述生物样品与所述电极面在相对于所述电极面垂直的方向上分开属于所述范围的距离而执行测定。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.12.22 JP 2015-249764;2016.03.18 JP 2016-055281.一种电化学测定方法，通过电化学方式测定溶液中的生物样品所生成或消耗的化学物质，该电化学测定方法的特征在于，作为已知条件包含与所述化学物质发生电子的转移而使氧化还原反应进行的工作电极的电极面的尺寸和所述生物样品的尺寸，以所述生物样品与所述电极面的相对于所述电极面垂直的方向的距离为变量，基于在所述生物样品中生成或消耗所述化学物质的化学反应的速度、所述溶液中的所述化学物质的浓度分布的变化和所述电极面上的与所述化学物质发生电子的转移的速度，进行计算出在所述工作电极中流通的电流的模拟，求出包含所述电流达到最大值的点在内、所述电流达到所述最大值的90％以上的大小的所述垂直方向距离的范围，在所述溶液中使所述生物样品与所述电极面在相对于所述电极面垂直的方向上分开属于所述范围的距离而执行测定。2.一种电化学测定方法，使用具备与所述化学物质发生电子的转移而使氧化还原反应进行且具有80μm以下的径尺寸del的电极面的工作电极，通过电化学方式测定溶液中的、具有100μm以上600μm以下的径尺寸的生物样品所生成或消耗的化学物质，该电化学测定方法的特征在于，在所述溶液中设置隔片，所述隔片具有相对于所述电极面垂直的方向的距离h1满足[计算式7]的轮廓面，并且在所述轮廓面的所述电极面侧的区域阻止所述生物样品侵入、容许所述溶液中的溶质扩散，在使所述生物样品沿着所述隔片的所述轮廓的状态下执行测定。3.一种电化学测定方法，使用具备与所述化学物质发生电子的转移而使氧化还原反应进行且具有80μm以下的径尺寸del的电极面的工作电极，通过电化学方式测定溶液中的、具有100μm以上600μm以下的径尺寸的生物样品所生成或消耗的化学物质，该电化学测定方法的特征在于，在所述溶液中设置隔片，所述隔片具有取决于与所述电极面的中心的相对于所述电极面平行的方向的距离m、相对于所述电极面垂直的方向的距离h2满足h2＝√{(1.05del+6.89)m}－0.48del－2.38±5[μm]、描绘研钵型的形状的轮廓面，并且在所述轮廓面的所述电极面侧的区域阻止所述生物样品侵入、容许所述溶液中的溶质扩散，在使所述生物样品沿着所述隔片的所述轮廓面位于所述电极面的中心的正上方的状态下进行测定。4.一种电化学测定装置，使用具备与所述化学物质发生电子的转移而使氧化还原反应进行的电极面的工作电极通过电化学方式测定溶液中的生物样品所生成或消耗的化学物质，该电化学测定装置的特征在于，所述电极面具有80μm以下的径尺寸del，在收纳所述溶液和所...

【专利技术属性】
技术研发人员：国方亮太，林泰之，须田笃史，伊野浩介，井上久美，末永智一，
申请(专利权)人：日本航空电子工业株式会社，国立大学法人东北大学，
类型：发明
国别省市：日本,JP