一种用于蛋白质高灵敏度检测的TSA-SERS传感器的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种用于蛋白质高灵敏度检测的TSA‑SERS传感器的制备方法，在SERS蛋白质传感器中引入TSA系统，将拉曼染料标记的金纳米粒子（SERS tag）连接酪胺分子上，通过HRP催化富集，将连有SERS tag的酶促产物沉积在传感器表面，放大SERS信号，从而实现检测灵敏度的提高。本发明专利技术可在生物分子浓度很低的情况下产生灵敏的信号，由于在低浓度下非特异性结合相对减少，进而改善反应的特异性，与此同时，还能减少生物分子的用量，降低实验成本。

A preparation method of TSA-SERS sensor for high sensitivity detection of protein

The invention discloses a preparation method of TSA_SERS sensor for high sensitivity detection of protein. TSA system is introduced into SERS protein sensor. The gold nanoparticles labeled with Raman dye (SERS tag) are linked to tyramine molecule, and the enzymatic products with SERS tag are deposited on the sensor surface by HRP catalytic enrichment. The SERS signal is amplified to improve the detection sensitivity. The invention can produce sensitive signals under the condition of very low biomolecule concentration, and improve the specificity of the reaction due to the relative reduction of non-specific binding at low concentration. At the same time, the dosage of biomolecule can be reduced and the experimental cost can be reduced.

【技术实现步骤摘要】
一种用于蛋白质高灵敏度检测的TSA-SERS传感器的制备方法
本专利技术属于SERS传感器领域，具体涉及一种用于蛋白质高灵敏度检测的TSA-SERS传感器的制备方法。
技术介绍
蛋白质对于生物体是必不可少的，它们是细胞生理代谢过程的重要组成部分。作为细胞中的主要功能分子，蛋白质能够与其他各类分子特异性地的结合。近年来，用来研究蛋白质结构和功能的方法不断涌现，包括荧光检测、比色检测以及电化学分析等。作为一种分析检测技术，SERS（表面增强拉曼散射）光谱具有灵敏度高、选择性好等优势，可以在水环境中检测物质的结构信息，对于生物体系的研究具有独特的优势。目前，SERS技术已经被用于创建多种生物传感器，例如利用SERS研究免疫识别过程或蛋白质与各类分子的相互作用等。然而，生物体系结构复杂，存在多种干扰物质以及非特异性结合，会在一定程度上影响SERS信号的高效获得。因此，建立高灵敏度的检测方法是SERS生物传感器不断向前发展的保证。为了提高SERS生物传感器的检测灵敏度，以往的报道提出过许多增强策略。例如，采用含有“热点”结构的活性基底来增强被测物的SERS信号，利用酶、核酸等与目标物的识别过程使信号分子恰好置于基底上的“热点”位置。但是，这些方法不仅需要复杂的制备技术和组装工艺，而且对仪器设备要求较高。同时，一个目标识别事件只能引入一个信号报告单元，这将大大的限制检测灵敏度的提高。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述不足，本专利技术的目的是提供一种用于蛋白质高灵敏度检测的TSA-SERS传感器的制备方法，解决现有方法制备的SERS传感器检测灵敏度不高的问题。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种用于蛋白质高灵敏度检测的TSA-SERS传感器的制备方法，包括以下步骤：在SERS蛋白质传感器中引入TSA系统，将拉曼染料标记的金纳米粒子连接在酪胺分子上，通过HRP催化富集，将连有金纳米粒子的酶促产物沉积在传感器表面，放大SERS信号，从而实现检测灵敏度的提高。TSA（酪胺信号放大）是一种酶介导的放大系统，在过氧化氢存在时，体系中的辣根过氧化物酶（HRP）催化酪胺分子（Tyramine）转化成一种活性中间体，该中间体可以迅速反应，共价结合在相接蛋白分子的富电子区域（比如色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基），通过将荧光染料或者其他标记物连接到酪胺分子上，可使其荧光信号或者其他相应信号在其沉积时得到放大。本专利技术在SERS蛋白质传感器中引入TSA系统，将拉曼染料标记的金纳米粒子（SERStag）连接酪胺分子上，通过HRP催化富集，将连有SERStag的酶促产物沉积在传感器表面，放大SERS信号，从而实现检测灵敏度的提高。作为优选，本专利技术用于蛋白质高灵敏度检测的TSA-SERS传感器的制备方法，包括以下步骤：S1、拉曼染料MBA（巯基苯甲酸）标记的金纳米粒子上连接酪胺分子：在MBA标记的金纳米粒子溶胶AuNP@MBA中，加入NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）、EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）以及tyramine，搅拌反应得到AuNP@MBA-tyramine溶胶，其中tyramine与MBA的摩尔比为1:1.5~3.5；S2、在基片上构筑从下到上依次叠加的抗体A-靶抗原-抗体B的三层结构：a、将表面有Auwafer的硅基片经MPA（巯基丙酸）溶液浸泡后，用PBS缓冲液冲洗，并经氮气吹干，得到表面羧基化的Auwafer基片；b、将表面羧基化的Auwafer基片浸入EDC和NHS的混合溶液中活化30~60min，随后将表面活化的Auwafer基片浸入到抗体A溶液中反应3~5h，然后用PBS缓冲液冲洗，将冲洗后的基片用2%的牛血清白蛋白封闭后，再用PBS缓冲液冲洗；c、将步骤b封闭后组装有抗体A的基片浸入待测抗原溶液中反应30~45min，得到组装有靶抗原的Auwafer基片，然后将组装有靶抗原的Auwafer基片浸入标记有辣根过氧化物酶的抗体B溶液中反应30~45min，得到抗体A-靶抗原-抗体B的Auwafer基片；S3：引发TSA反应，用于SERS免疫检测：在步骤S1制备的AuNP@MBA-tyramine溶胶中加入H2O2，混匀后滴加至步骤c得到的抗体A-靶抗原-抗体B的Auwafer基片上进行反应，随后用超纯水冲洗，并经氮气吹干后，进行SERS检测。在上述步骤S1中，tyramine与MBA的摩尔比是指步骤S1中加入的tyramine的摩尔数与制备AuNP@MBA时加入的MBA的摩尔数之比。tyramine通过末端的氨基与MBA的羧基发生反应，连接在金纳米粒子表面，其中EDC可催化MBA和NHS反应，NHS使MBA的羧基端酰化，进一步和tyramine末端的氨基发生反应。NHS和EDC主要起催化作用，用量可根据需要适量添加，为便于反应，可将NHS、EDC和tyramine用适量的水配制成溶液添加，tyramine的用量不宜太多，过多会导致AuNP@MBA溶胶发生聚集。NHS、EDC和tyramine配制成溶液的浓度可分别优选为1mg/mL、2mg/mL、10-4mol/L。在上述步骤a中，硅基片表面Auwafer的厚度可为30~100nm，MPA溶液浓度可为10-3mol/L，浸泡时间可为1~3h，PBS缓冲液的pH可为7.4。在上述步骤b中，EDC可催化MPA和NHS反应，使MPA的羧基端酰化，以利于抗体A的连接，抗体A通过氨基与羧基反应，连接在基片表面，PBS缓冲液冲洗主要是去除未反应的抗体A，2%的牛血清白蛋白主要是封闭基片上未反应的位点。在上述步骤c中，组装有抗体A的基片浸入待测抗原溶液中，抗原可与抗体A发生免疫识别反应，组装到基片表面。在上述步骤S3中，H2O2可以促进HRP氧化tyramine形成活性自由基，进而将大量的标记有MBA的金纳米粒子组装到Auwafer基片表面，产生强烈的SERS信号，H2O2作为催化剂，添加适量即可，反应时间可为20~40min。作为优选，步骤S1反应完成后，将得到的溶胶进行离心，并用二次蒸馏水重悬浮。离心的目的主要是去掉过量的tyramine分子。作为优选，步骤S1中搅拌反应时间为1~3h。反应时间会影响AuNP@MBA溶胶的稳定性，时间过长会破坏AuNP@MBA溶胶的稳定性，容易发生聚集。作为优选，步骤b中EDC和NHS的混合溶液中，EDC和NHS的浓度分别为1~10mg/mL、2~20mg/L。EDC和NHS作为催化剂，浓度过高会使金纳米离子发生聚集。作为优选，步骤b中抗体A的浓度为1~10μg/mL，步骤c中抗体B的浓度为1~3μg/mL。抗体A和抗体B的浓度会影响组装效率，浓度太低组装太慢。在实际中，可使待测抗原的浓度低于抗体A和抗体B的浓度，保证待测抗原全部组装，抗体B的浓度也以低于抗体A的浓度为宜。作为优选，步骤b中基片与抗体A的反应温度为2~6℃。在此温度下，可较稳定的保存抗体蛋白的空间结构，反应温度可进一步优选为4℃。作为优选，步骤c中基片与待测抗原反应及与抗体B反应的温度为15~40℃。在一定的范围内，温度升高有利于抗原抗体结合，但是温度不宜过高，太高会导致已结合的抗原抗体再解离，甚至变形或破坏。本专利技术对使用的抗体和抗原无特别要求，配对即可本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于蛋白质高灵敏度检测的TSA‑SERS传感器的制备方法，其特征在于，在SERS蛋白质传感器中引入TSA系统，将拉曼染料标记的金纳米粒子连接在酪胺分子上，通过HRP催化富集，将连有金纳米粒子的酶促产物沉积在传感器表面，放大SERS信号，从而实现检测灵敏度的提高。

【技术特征摘要】
1.一种用于蛋白质高灵敏度检测的TSA-SERS传感器的制备方法，其特征在于，在SERS蛋白质传感器中引入TSA系统，将拉曼染料标记的金纳米粒子连接在酪胺分子上，通过HRP催化富集，将连有金纳米粒子的酶促产物沉积在传感器表面，放大SERS信号，从而实现检测灵敏度的提高。2.根据权利要求1所述的用于蛋白质高灵敏度检测的TSA-SERS传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、拉曼染料MBA标记的金纳米粒子上连接酪胺分子：在MBA标记的金纳米粒子溶胶AuNP@MBA中，加入NHS、EDC以及tyramine，搅拌反应得到AuNP@MBA-tyramine溶胶，其中tyramine与MBA的摩尔比为1:1.5~3.5；S2、在基片上构筑从下到上依次叠加的抗体A-靶抗原-抗体B的三层结构：a、将表面有Auwafer的硅基片经巯基丙酸溶液浸泡后，用PBS缓冲液冲洗，并经氮气吹干，得到表面羧基化的Auwafer基片；b、将表面羧基化的Auwafer基片浸入EDC和NHS的混合溶液中活化30~60min，随后将表面活化的Auwafer基片浸入到抗体A溶液中反应3~5h，然后用PBS缓冲液冲洗，将冲洗后的基片用2%的牛血清白蛋白封闭后，再用PBS缓冲液冲洗；c、将步骤b封闭后组装有抗体A的基片浸入待测抗原溶液中反应30~45min，得到组装有靶抗原的Auwafer基片，然后将组装有靶抗原的Auwafer基片浸入标记有辣根过氧化物酶的抗体B溶液中反应...

【专利技术属性】
技术研发人员：付翠翠，俞志刚，石文兵，吴燕，
申请(专利权)人：长江师范学院，
类型：发明
国别省市：重庆,50