本发明专利技术公开了一种合征姬蛙的物种特异性PCR鉴定引物，COI基因的目的片段，包括：上游引物序列L1 5'‑GGC CCC CGC TAT ACG AAA AAC‑3'；下游引物序列：H1 5'‑GGC AGG GGT GAA GTT GTC TGG G‑3'。本发明专利技术通过从合征姬蛙肌肉组织中提取其DNA，在对提取后的DNA进行PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳检测，利用本发明专利技术提供的PCR引物对，进而根据琼脂糖凝胶电泳检测结果中是否出现条带来鉴定其是否为合征姬蛙。这种鉴定方式，相较于传统DNA测序及序列比对既简单又准确，仅需通过一次PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测即可鉴定是否为合征姬蛙，缩短了检测时间，提高了检测效率，兼具简便性及经济性的效果。
【技术实现步骤摘要】
一种用于鉴定合征姬蛙物种特异性的PCR引物
本专利技术涉及生物检测鉴定领域，具体为一种用于鉴定合征姬蛙物种特异性的PCR引物。
技术介绍
姬蛙属的两栖动物种类繁多，包括饰文姬蛙、合征姬蛙、粗皮姬蛙、小弧斑姬蛙、花姬蛙等，它们的分布范围广泛，并且分布的区域经常有重叠。合征姬蛙的学名为Microhylamixtura，是中国的特有物种，是姬蛙科姬蛙属的两栖动物。它分布于安徽、湖北、四川、陕西、贵州等地，多生活于山区小水坑，高山稻田及附近。其生存的海拔范围为140至1700米。本课题组科研人员在采集合征姬蛙标本过程中发现不同采集地点的合征姬蛙形态大小上有较大的区别，可能已经出现种或亚种的分化，因此单纯依据形态大小特征去鉴别合征姬蛙有较大的困难，并且在有些采集地点发现合征姬蛙和饰文姬蛙、花姬蛙等共同生活在一起，有些科研人员鉴别错误，经常错把饰文姬蛙等当做合征姬蛙，因此我们需要从分子水平上设计一种特定引物来鉴定合征姬蛙的物种特异性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述
技术介绍
困难，提供一种通过PCR扩增凝胶电泳检测鉴定合征姬蛙的物种特异性的PCR鉴定引物。为达到上述目的，本专利技术提供了一种合征姬蛙的物种特异性PCR鉴定引物，所述物种特异性PCR鉴定引物为COI基因的目的片段，包括：上游引物序列:L15'-GGCCCCCGCTATACGAAAAAC-3'；下游引物序列:H15'-GGCAGGGGTGAAGTTGTCTGGG-3'。本专利技术通过从合征姬蛙肌肉组织中提取其DNA，在对提取后的DNA进行PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳检测，利用本专利技术提供的PCR引物对，进而根据琼脂糖凝胶电泳检测结果中是否出现条带来鉴定其是否为合征姬蛙。这种鉴定方式，相较于传统DNA测序及序列比对既简单又准确，仅需通过一次PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测即可鉴定是否为合征姬蛙，缩短了检测时间，提高了检测效率，兼具简便性及经济性的效果。附图说明图1为本专利技术合征姬蛙的物种特异性PCR鉴定引物在具体实施例中的样品PCR产物凝胶电泳检测结果图。具体实施方式下面结合实施例及附图进一步介绍本专利技术，但本专利技术不仅限于下述实施例，可以预见本领域技术人员在结合现有技术的情况下，实施情况可能产生种种变化。本专利技术提供了一种合征姬蛙的物种特异性PCR鉴定引物，所述物种特异性PCR鉴定引物为COI基因的目的片段，包括：上游引物序列:L15'-GGCCCCCGCTATACGAAAAAC-3'；下游引物序列:H15'-GGCAGGGGTGAAGTTGTCTGGG-3'。采用上述合征姬蛙的物种特异性PCR鉴定引物的鉴定方法，步骤是：1）、从待鉴定样品肌肉组织中提取其DNA；2）、使用上述合征姬蛙的物种特异性PCR鉴定引物对步骤1）中提取的DNA进行PCR扩增；3）、将步骤2）得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测泳道中是否出现目的扩增条带。上述步骤3）中检测是否出现1000bp条带。实施例：（一）实验用仪器设备PCR扩增仪型号Bio-RadMyCleThermalCycle,Bio-RadCompanyUVP紫外凝胶成像分析系统BioradGelDocXR，美国伯乐公司电泳槽型号DYY-III，北京市六一仪器厂电泳仪型号EPS，北京市六一仪器厂电子天平型号JY3002，上海精密科学仪器有限公司数显恒温水浴锅型号HH-1B，常州国华电器有限公司立式压力蒸汽灭菌器型号LS-B50L，江苏省江阴市液化石油气设备厂精密微量移液器Eppendorf，Germany台式高速冷冻离心机型号3K30,1-15K,Sigma,Germany超净工作台型号SW-CJ-2FD，苏净安泰有限公司（二）总DNA的提取A．溶液的配制研究过程中，总DNA的提取采用SNET法。SNET溶液的配制方法如下：（a）配制SNET溶液母液的方法：（1）用电子天平称取Nacl29.2g溶解于100ml灭菌过的蒸馏水中，待用。（2）用电子天平称取SDS10g溶解于灭菌过的蒸馏水90ml中，搅拌，定容至100ml，制成10%SDS母液待用。（3）用电子天平称取Na2EDTA.2H2O固体18.61g+NaOH固体2g，再加70ml灭菌过的蒸馏水,置于水浴锅中50℃温浴，溶解后定容至100ml，即制成0.5mol/lEDTA（pH=8）母液，待用。（4）用电子天平称取Tris-Base12.11g，置于灭菌过的蒸馏水80ml中溶解，再加4.2ml浓HCL，搅拌，溶解，定容至100ml，即制成1mol/lTris-CL（pH=8）母液，待用。（b）用配制好的SNET溶液母液配制SNET工作液，方法如下：（1）用量筒量取5mol/lNacl母液8ml；（2）用量筒量取10%SDS母液10ml；（3）用量筒量取1ml0.5mol/lEDTA（pH=8）母液1ml；（4）用量筒量取1mol/lTris-CL（pH=8）母液2ml；（5）用灭菌过的蒸馏水将上述混合液定容至100ml，即制成100ml的SNET工作液。B.总DNA的提取步骤（1）材料处理:a.将镊子灭菌，然后用其撕取适量的腿部肌肉放入离心管，加入196ul的裂解液（SNET）,再加入4ul的蛋白酶k（ProteinaseK），用研磨棒充分研磨至液体清亮，无颗粒；b.将上述离心管放入水浴锅，50度水浴不超过24小时。（2）总DNA提取a.取200ul裂解好的液体，每管加Tris—平衡酚200ul充分混匀，8000转离心5分钟；b.取上清，每管加等体积（约200ul）氯仿和异戊醇的混合液（体积比24:1）,8000转离心5分钟；c.取上清，每管加与上清等体积（约200ul）的异丙醇（冰），8000转离心15分钟，得DNA沉淀；d.弃上清，加70%乙醇1000ul，振荡，16000转离心5分钟；e.弃上清，倒扣，干燥；f.加20ul无菌水溶解，4℃过夜，–20℃保存。(三)PCR扩增及测序COI基因的目的片段长度为680bp左右，引物由自己设计：上游引物序列L15'-GGCCCCCGCTATACGAAAAAC-3'和下游引物序列H15'-GGCAGGGGTGAAGTTGTCTGGG-3'；每一样品的扩增体系为25μL，反应体系如下表：扩增反应在伯乐公司生产的PCR仪上进行。PCR反应程序如下：扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。如图1为本专利技术合征姬蛙的物种特异性PCR鉴定引物的实施例样品PCR产物凝胶电泳检测结果图。用胶回收试剂盒TIANquickMidiPurificationKit(Tiangen,Beijing,China)对样品进行纯化回收，PCR产物委托北京六合华大生物科技有限公司使用测序试剂盒ABIPrismBigdyeTMTerminatorCycleSequencingReadyReactionKit在ABI3730XL型测序仪上双向测序。所有序列已经提交GenBank，序列号为KC195920–KC195952。序列表SEQUENCELISTING<110>遵义医学院<120>一种用于鉴定合征姬蛙物种特异性的PCR引物<130>2018<160&a本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种合征姬蛙的物种特异性PCR鉴定引物，其特征是：所述物种特异性的PCR鉴定引物为COI基因的目的片段；包括：上游引物序列 L1 5'‑ GGC CCC CGC TAT ACG AAA AAC ‑3' ；下游引物序列 H1 5'‑GGC AGG GGT GAA GTT GTC TGG G ‑3'。
【技术特征摘要】
1.一种合征姬蛙的物种特异性PCR鉴定引物，其特征是：所述物种特异性的PCR鉴定引物为COI基因的目的片段；包括：上游引物序列L1...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵彦禹，
申请(专利权)人：遵义医学院，
类型：发明
国别省市：贵州,52
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