一种抗性愈伤组织的筛选方法技术

本申请公开了一种抗性愈伤组织的筛选方法，包括以下步骤：挑取介导转化后的愈伤组织于培养皿中，愈伤组织表面若无菌体存在则可不用无菌水进行冲洗，若有菌体存在则用无菌水于120rpm条件下冲洗3‑5次，最后一次用含500mg/L Cef的无菌水静置1h。置于无菌滤纸上干燥30min，直至愈伤组织表面无可见农杆菌存在。本发明专利技术方法通过改变培养温度和培养时间，缩短农杆菌介导转化水稻的进程，并提高了水稻愈伤组织的诱导率和转化率。

A screening method for resistant callus

The application discloses a screening method for resistant callus, which comprises the following steps: selecting the transformed callus in a dish, washing the surface of the callus without sterile water if there is no bacteria, washing it with sterile water for 3 to 5 times under 120 RPM condition if there is a bacteria, and washing it with 500 mg/m for the last time. L Cef aseptic water stationary 1H. 30min was dried on sterile filter paper until there was no visible Agrobacterium on the surface of callus. The method shortens the process of rice transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens by changing the culture temperature and time, and improves the induction rate and transformation rate of rice callus.

【技术实现步骤摘要】
一种抗性愈伤组织的筛选方法
本专利技术分子生物学组织培养和转基因技术交叉
，特别涉及一种抗性愈伤组织的筛选方法。
技术介绍
水稻(OryzasativaL.)不仅是主要的粮食作物也是单子叶植物基础研究的模式植物。随着世界人口的不断增长以及人们生活水平的提高，从而对水稻产量和品质提出了更高的要求。传统育种具有育种年限长，需连续自交才能选育出需要的优良性状已经很难满足需求，通过现代生物技术与传统育种技术相结合来提高水稻的产量和质量已成为今后主要的发展趋势。随着分子生物学的发展，越来越多的参与植物抗病有关的基因被分离出来，如防卫反应有关的基因、参与抗病信号传导的基因，参与对病原物识别的基因等，要鉴定这些基因在植物抗病性中的作用和地位，就要构建转化植物的双元载体如超量表达、反义和RNA干涉的双元载体转化植物，来明确该基因在植物抗病中的作用。水稻上常用的遗传转化方法分为DNA直接导入法和农杆菌介导的转化法。DNA直接导入法主要包括PEG(polyethyleneglycol)介导的转化法、电击转化法、基因枪转化法和花粉管通道转化法。其中PEG法、电穿孔法以原生质体为受体，由于对原生质体再生的依赖而在应用上受到很大限制。基因枪法优点是受体广泛，不受寄主范围的限制，转化率较高，但和其它DNA直接导入法一样存在共同的缺点：外源DNA的整合方式复杂，常常是多拷贝插入，较易出现转基因沉默现象，转化的外源基因片断不能太大(上限是16-20kb)，转入基因的分离有时呈非孟德尔遗传等。同DNA直接导入法相比，农杆菌介导的转化法不需要原生质体的培目前，在现有技术水稻愈伤组织诱导培养中，其培养温度为26℃培养9-12天，农杆菌介导转化水稻共培养的时间为2天，在愈伤组织诱导培养阶段采取低温处理培养时间长，水稻愈伤组织的出愈率和愈伤组织质量较差，愈伤组织的诱导率和转化率低。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于，提供了一种农杆菌介导水稻遗传转化方法。本专利技术方法通过改变培养温度和培养时间，缩短农杆菌介导转化水稻的进程，并提高了水稻愈伤组织的诱导率和转化率。为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种抗性愈伤组织的筛选方法，包括以下步骤：挑取介导转化后的愈伤组织于培养皿中，愈伤组织表面若无菌体存在则可不用无菌水进行冲洗，若有菌体存在则用无菌水于120rpm条件下冲洗3-5次，最后一次用含500mg/LCef的无菌水静置1h。进一步包括：置于无菌滤纸上干燥30min，直至愈伤组织表面无可见农杆菌存在。进一步包括：将愈伤组织转移至含Hyg20-25mg/L和200-400mg/LTimentin的筛选培养基进行筛选抗性愈伤，28℃暗培养，15d筛选一次，共筛选两次。一种抗性愈伤组织的分化方法，包括以下步骤：从筛选后长出的抗性愈伤组织中，挑选乳黄色致密的抗性愈伤组织转至含有Hyg20-25mg/L和200-400mg/LTimentin的分化培养基上，先暗培养7d，然后转至15h/d光照条件下培养，经过15d长出新的抗性愈伤并且出现绿点。进一步包括：挑选乳黄色致密有绿点的抗性愈伤组织转接于新的分化培养基上，于25d后进一步分化出小苗。进一步包括：定期在超净工作台通风干燥抗性愈伤，防止分化的抗性愈伤水化。一种PCR抗性检测方法，包括以下步骤：DNA提取：取2cm长的水稻叶片置于2ml离心管中；在研钵中加入800μL1.5XCTAB，研磨叶片至匀浆并倒回离心管内；65℃水浴20-30min，每5min颠倒混匀1次；加入等体积的24∶1氯仿/异戊醇，上下颠倒混匀，持续10min；10000rpm离心10min；吸取400μL上清液至新的离心管，加入2倍体积经冰预冷的95％乙醇，-20℃冰置20min；12000rpm离心15min；弃上清，加入500μL75％乙醇，颠倒漂洗，12000rpm离心5min；弃上清，置于超净台吹干或自然晾干，加100μLddH2O溶解DNA。进一步包括：以Hyg基因设计引物序列：F1：5′-GGACTTCGGGGCAGTCCT-3′；R1：5′-CGATGTAGGAGGGCGTGG-3′为引物。进一步包括：PCR反应程序和体系如下：程序：94℃预变性5min，94℃变性45s，55℃退火45s；72℃延伸1.5min；30个循环；72℃再延伸10min；16℃结束；反应在20μL体系中进行，其中包括：10×EasyTaqBuffer(+Mg2+)2μL，DNA模板1μL，2mMdNTPs2μL，10μM/L的正向，反向引物各1μL，5U/μLTaqDNA聚合酶1μL，ddH2O补足至20μL。一种如前述任一项方法制备的水稻愈伤组织。本专利技术有益效果包括：本专利技术农杆菌介导水稻遗传转化方法在愈伤组织诱导培养阶段采取低温处理并缩短培养时间，水稻愈伤组织的出愈率和愈伤组织质量相较常规方法较好，在共培养阶段降低培养温度，缩短培养时间获得相对常规方法较好的转化率，本专利技术在缩短农杆菌介导转化水稻进程的同时还提高了愈伤组织的诱导率和转化率。附图说明图1为本专利技术实施例所述20℃培养时水稻愈伤组织的诱导情况照片；图2为本专利技术实施例所述26℃培养时水稻愈伤组织的诱导情况照片；图3为本专利技术实施例所述实验组抗性苗生根2天时生长情况照片；图4为本专利技术实施例所述PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。具体实施方式下面结合实施例详述本专利技术。为使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本专利技术进一步详细说明，但本专利技术并不局限于这些实施例。如无特别说明，本专利技术的实施例中的原料和催化剂均通过商业途径购买。本专利技术选用水稻品种日本晴为实验材料，农杆菌菌株为含目的基因载体的农杆菌EHA105。如表1所示，为本专利技术试剂说明：表1本专利技术试剂说明在本专利技术一实施例中，提供了一种农杆菌介导水稻遗传转化方法，其实验操作步骤为：1)诱导：水稻种子去壳消毒后，将成熟胚接种于诱导培养基中，诱导胚性愈伤组织；2)侵染：将步骤1)所得愈伤组织与胚乳、芽分离，接种于农杆菌悬浮液中侵染，之后晾干待用；3)共培养：将晾干的愈伤组织转到共培养基中，培养至愈伤组织表面出现菌体；4)筛选：将共培养后的愈伤组织清洗后接种到筛选培养基中进行抗性筛选，获得抗性愈伤组织；5)分化：将获得的抗性愈伤组织接种到分化培养基上培养至分化出幼苗；6)生根：将幼苗接种到生根培养基上生根，并进行PCR检测，选择检测为阳性的植株作为转化得到的粳稻植株；所涉培养基的具体配方如下：YEB培养基：酵母提取物0.8-1.2g/L；蛋白胨4.5-5.0g/L；牛肉膏4.5-5.0g/L；蔗糖4.0-6.0g/L；硫酸镁0.3-0.5g/L；琼脂12-15g/L；pH6.8-7.2；诱导培养基：NB；2，4-D1.8-2.0mg/mL；6-BA0.1-0.2mg/mL；琼脂粉10-15g/L；继代培养基：NB；2，4-D1.8-2.0mg/mL；CH0.2-0.3g/L；蔗糖28-30g/L；琼脂粉10-15g/L；共培养培养基：NB；AS100-200umol/L；筛选培养基：NB；2，4-D1.8-2.0mg/mL；6-BA0.1-0.2mg/mL；Hyg20-25mg/L，Timentin200-400m本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗性愈伤组织的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：挑取介导转化后的愈伤组织于培养皿中，愈伤组织表面若无菌体存在则可不用无菌水进行冲洗，若有菌体存在则用无菌水于120rpm条件下冲洗3‑5次，最后一次用含500mg/L Cef的无菌水静置1h。

【技术特征摘要】
1.一种抗性愈伤组织的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：挑取介导转化后的愈伤组织于培养皿中，愈伤组织表面若无菌体存在则可不用无菌水进行冲洗，若有菌体存在则用无菌水于120rpm条件下冲洗3-5次，最后一次用含500mg/LCef的无菌水静置1h。2.根据权利要求1所述抗性愈伤组织的筛选方法，其特征在于，进一步包括：置于无菌滤纸上干燥30min，直至愈伤组织表面无可见农杆菌存在。3.根据权利要求1所述抗性愈伤组织的筛选方法，其特征在于，进一步包括：将愈伤组织转移至含Hyg20-25mg/L和200-400mg/LTimentin的筛选培养基进行筛选抗性愈伤，28℃暗培养，15d筛选一次，共筛选两次。4.一种抗性愈伤组织的分化方法，其特征在于，包括以下步骤：从筛选后长出的抗性愈伤组织中，挑选乳黄色致密的抗性愈伤组织转至含有Hyg20-25mg/L和200-400mg/LTimentin的分化培养基上，先暗培养7d，然后转至15h/d光照条件下培养，经过15d长出新的抗性愈伤并且出现绿点。5.根据权利要求4所述抗性愈伤组织的分化方法，其特征在于，进一步包括：挑选乳黄色致密有绿点的抗性愈伤组织转接于新的分化培养基上，于25d后进一步分化出小苗。6.根据权利要求4所述抗性愈伤组织的分化方法，其特征在于，进一步包括：定期在超净工作台通风干燥抗性愈伤，防止分化的抗性愈伤水化。7.一种PCR抗性检测方法，其特征在于，包括以下步骤：DNA提取：取...

【专利技术属性】
技术研发人员：张国栋，刘佳音，修旺珊，王克响，孙伟航，米铁柱，
申请(专利权)人：青岛袁策生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37