一种胰岛β细胞体外制备方法技术

本发明专利技术公开了一种胰岛β细胞体外制备方法，该方法为外泌体连续孵育诱导干细胞分化，包括以下步骤：(1)外泌体提取；(2)外泌体电镜观察；(3)Western blotting分析外泌体标志物的表达；(4)外泌体诱导iPSCs定向分化；(5)β细胞功能验证；(6)胰岛β细胞外泌体miRNA功能验证。实验结果表明miRNA在iPSCs分化为β细胞中起到重要作用；根据实验数据分析及miRNA的功能筛查、验证，发现外泌体中miR‑212/132具有促进iPSCs向胰岛β细胞定向分化的功能。

【技术实现步骤摘要】
一种胰岛β细胞体外制备方法
本专利技术涉及胰岛β细胞体外诱导
，特别是涉及利用胰岛β细胞源外泌体诱导干细胞分化为胰岛β细胞。
技术介绍
糖尿病(DiabetesMellitus，DM)已成为继肿瘤、心脑血管后的第三大威胁人类健康和影响人们生活质量的疾病，根据国际糖尿病联合会(InternationalDiabetesFederation,IDF)2015年12月发布的统计数据，在全球范围内20～79岁成人中约有8.8％的人患有糖尿病，这意味着全球约有4.15亿糖尿病患者。WorldHealthOrganization(WHO)在2016年4月6日最新报告显示，这个数字上升到4.22亿，而中国糖尿病患者人数超过1亿人，其中I型糖尿病患者超过100万人，居全球之首。目前胰岛素治疗仅是维持糖尿病患者生命的方法，但使用胰岛素治疗I型糖尿病(TypeIDiabetesMellitus，T1DM)并不能阻止其并发症的发生。I型糖尿病又称胰岛素依赖型糖尿病，是由于机体产生异常自身免疫应答引起胰岛β细胞损伤，胰岛素分泌减少的一类疾病，其发病率正在以3～5％的速度逐年提高。目前尚没有有效的手段根治I型糖尿病，不合理的胰岛素补充所导致的高血糖或低血糖现象严重，以致各种并发症接踵而至，患者寿命普遍缩短。为了有效控制血糖，防止糖尿病并发症的发生，提高糖尿病患者的生存质量，替代被患者自身免疫系统破坏的胰岛素分泌细胞，加拿大学者在2000年报道新型胰岛细胞分离纯化技术和无激素免疫抑制方案(Shapiro,A.M.；Lakey,J.R.；Ryan,E.A.；Korbutt,G.S.；Toth,E.；Warnock,G.L.；Kneteman,N.M.；Rajotte,R.V.7名一型糖尿病病人使用无激素免疫抑制剂进行胰岛移植，新英格兰医学杂志)，使成人胰岛细胞移植的临床应用成为可能，胰岛细胞移植蓬勃兴起。但进行胰岛移植术时，根据胰岛当量的计算，每千克体重需要2×106细胞的β细胞量，所以胰岛移植术面临的首要问题即解决胰岛β细胞的来源，干细胞技术的蓬勃发展给体外胰岛β细胞供给带来新的希望。干细胞向胰岛β细胞分化是目前解决胰岛来源短缺的快速途径，目前已在体外诱导成功的干细胞包括胚胎干细胞、间充质干细胞、诱导性多能干细胞以及胰腺干细胞等。外泌体(exosome)是一种由细胞分泌，直径在40～100nm左右的微小囊泡，其间包含了丰富的miRNA、lncRNA、circRNA、mRNA以及蛋白质，能够参与细胞之间的物质转导和信号交流，并具有母源细胞的特异性。目前，干细胞定向分化为胰岛β细胞的方法主要为化学试剂诱导分化法，该方法不但影响细胞活性，还存在基因突变的风险。考虑到外泌体存在大量细胞通讯用的生物信息，并包涵细胞特异的RNA和蛋白质，利用外泌体生物学功能作为干细胞的定向诱导因子，避免了化学试剂对细胞刺激产生的基因序列突变，又保证了定向分化后的细胞活性，是目前干细胞定向分化的最佳诱导方法。MicroRNA(miRNA)是片段长度为20～25核苷酸的非编码单链RNA分子，参与生物有机体的转录后基因表达调控。近年来发现，miRNA参与干细胞的转录后调控，影响干细胞的分化和增殖，调控特异性miRNA的表达水平，可以诱导干细胞向特定组织细胞分化，miRNA在某种程度上决定了干细胞的命运，这为疾病的治疗提供了新技术与新思路。胰岛β细胞分泌的外泌体中生物信息与细胞即时表达的基因及其相似，Claudianeetal.报道胰岛β细胞外泌体表达的microRNA种类及丰度与来源细胞的表达一致，仅个别miRNA存在差异。而胰岛特异性的microRNA在胰岛β细胞外泌体中均表达，如miRNA-375、miRNA-124、iRNA-212、miRNA-26a、let-7和miRNA-9等(Guay,C.；Menoud,V.；Rome,S.；Regazzi,R.外泌体miRNA在胰岛β细胞间传递细胞凋亡信号，细胞通讯信号)。因此，根据外泌体与其来源细胞的生物信息的相似性，应用外泌体作为多能干细胞的诱导因子将成为一种高效且安全的诱导方法。。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种安全、高效体外分化胰岛β细胞的方法。本专利技术采用的技术方案如下：一种胰岛β细胞体外制备方法，该方法为外泌体连续孵育诱导干细胞分化方法。本专利技术所述的胰岛β细胞体外制备方法，其中，所述干细胞为人iPSCs；所述外泌体来源为成熟胰岛β细胞。本专利技术所述的胰岛β细胞体外制备方法，其中，所述外泌体中产生功能的因素为miR-212/132。本专利技术所述的胰岛β细胞体外制备方法，包括以下步骤：(1)外泌体提取应用血清替代物替代培养基中的血清，体外培养人β细胞，细胞培养过程中每隔两天收集培养上清，使用超速离心法分离细胞培养基中的外泌体；(2)外泌体电镜观察(3)Westernblotting分析外泌体标志物的表达(4)外泌体诱导iPSCs定向分化①收集获得的外泌体采用蛋白的BCA法计算浓度，采用收集的外泌体对iPSCs进行定向诱导，外泌体诱导剂量按照蛋白浓度计算，每微升培养基中需添加0.2微克外泌体；②加入iPSCs培养基中连续诱导10天，对所分化细胞进行β细胞标志物表达初步分析，包括免疫荧光和流式细胞术分析β细胞标志物的表达；(5)β细胞功能验证①分别采用两种不同浓度葡萄糖的刺激液，刺激液A5.5mM和刺激液B20.5mM；具体操作：弃原诱导液，PBS洗2次，加入不含血清的刺激液，2h后分别收集培养液，利用ELISA方法检测胰岛素的分泌表达；②分别收集3×106分化的β细胞注射到4周龄免疫缺陷小鼠肾包膜下；2周后，按照2g/kg体重腹腔内注射葡萄糖(+)-D-glucose，分别在注射前0min和注射后30min，使用高敏感ELISA试剂盒检测小鼠血清中人insulin的水平；并对比表达量的变化；(6)胰岛β细胞外泌体miRNA功能验证①验证外泌体中miRNA在β细胞分化中的作用，对Dicer酶进行shRNA设计，筛选有效的shRNA敲减Dicer表达，阻断pre-miRNA的有效剪切，降低maturemiRNA的表达量；筛选有效的shRNA并通过慢病毒载体侵染iPSCs，进行外泌体孵育法定向诱导其分化，流式细胞术分析β细胞分化效率变化；其中shRNA序列如序列表中SEQIDNo:1所示；②利用miRNAmicroarray检测iPSCs、β细胞及其外泌体中miRNA的表达，对比分析两种细胞及其外泌体中miRNA的表达特征，realtime-PCR验证miRNAmicroarray的实验结果，分析差异显著且与胰岛发育相关的特异miRNA。本专利技术所述的胰岛β细胞体外制备方法，其中，所述外泌体来源为成熟胰岛β细胞。本专利技术所述的胰岛β细胞体外制备方法，其中，所述外泌体中miR-212/132具有促进iPSCs向胰岛β细胞定向分化的功能。本专利技术所述的胰岛β细胞体外制备方法，其中，所述步骤(1)中，将要提取的细胞培养上清液10ml，在4℃的环境下，300g10min，2000g20min，弃沉淀，去除细胞，然后10,000g30min，弃沉淀，去除亚细胞成分，再用10,000g60min，弃掉上清液，最后所得沉本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种胰岛β细胞体外制备方法，其特征在于：该方法为外泌体连续孵育诱导干细胞分化方法。

【技术特征摘要】
1.一种胰岛β细胞体外制备方法，其特征在于：该方法为外泌体连续孵育诱导干细胞分化方法。2.根据权利要求1所述的胰岛β细胞体外制备方法，其特征在于：所述干细胞为人iPSCs；所述外泌体来源为成熟胰岛β细胞。3.根据权利要求2所述的胰岛β细胞体外制备方法，其特征在于：所述外泌体中产生功能的因素为miR-212/132。4.根据权利要求3所述的胰岛β细胞体外制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)外泌体提取应用血清替代物替代培养基中的血清，体外培养人β细胞，细胞培养过程中每隔两天收集培养上清，使用超速离心法分离细胞培养基中的外泌体；(2)外泌体电镜观察(3)Westernblotting分析外泌体标志物的表达(4)外泌体诱导iPSCs定向分化①收集获得的外泌体采用蛋白的BCA法计算浓度，采用收集的外泌体对iPSCs进行定向诱导，外泌体诱导剂量按照蛋白浓度计算，每微升培养基中需添加0.2微克外泌体；②加入iPSCs培养基中连续诱导10天，对所分化细胞进行β细胞标志物表达初步分析，包括免疫荧光和流式细胞术分析β细胞标志物的表达；(5)β细胞功能验证①分别采用两种不同浓度葡萄糖的刺激液，刺激液A5.5mM和刺激液B20.5mM；具体操作：弃原诱导液，PBS洗2次，加入不含血清的刺激液，2h后分别收集培养液，利用ELISA方法检测胰岛素的分泌表达；②分别收集3×106分化的β细胞注射到4周龄免疫缺陷小鼠肾包膜下；2周后，按照2g/kg体重腹腔内注射葡萄糖(+)-D-glucose，分别在注射前0min和注射后30min，使用高敏感ELISA试剂盒检测小鼠血清中人insulin的水平；并对比表达量的变化；(6)胰岛β细胞外泌体miRNA功能验证①验证外泌体中miRNA在β细胞分化中的作用，对Dicer酶进行shRNA设计，筛选有效的shRNA敲减Dicer表达，阻断pre-miRNA的有效剪切，降低maturemiRNA的表达量；筛选有效的shRNA并通过慢病毒载体侵染iPSCs，进行外泌体孵育法定向诱导其分化，流式细胞术分析β细胞分化效率变化；其中shRNA序列如序列表中SEQIDNo:1所示；②利用miRNAmicroarray检测iPSCs、β细胞及其外泌体中miRNA的表达，对比分析两种细胞及其外泌体中miRNA的表达特征，realtime-PCR验证miRNAmicroarray的实验结果，分析差异显著且与胰岛发育相关的特异miRNA。5.根据权利要求4所述的胰岛β细胞体外制备方法，其特征在于：所述外泌体来源为成熟胰岛β细胞。6.根据权利要求5所述的胰岛β细胞体外制备方法，其特征在于：所述外泌体中miR-212/132具有促进iPSCs向胰岛β细胞定向分化的功能。7.根据权利要求6所述的胰岛β细胞体外制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，将要提取的细胞培养上清液10ml，在4℃的环境下，300g10min，2000g20min，弃沉淀，去除细胞，然后10,000g30min，弃沉淀，去除亚细胞成分，再用10,000g60min，弃掉上清液，最后所得沉淀即为exosome。8.根据权利要求7所述的胰岛β细胞体外制备方法，其特征在于：所述步骤(2)具体包括：①标本固定：将外泌体用2.5％戊二醛4℃固定2h，移入青霉素小瓶中，在4℃条件下用PBS漂洗3次，每次5min；再用四氯化锇4℃固定30min，接着用PBS漂洗3次；②脱水：50％丙酮溶液，10min，1次；70％丙酮溶液，10min，1次；90％丙酮溶液，10min，2次；100％丙酮溶液，10min，3次；③浸透：吸去瓶中脱水剂，加入3ml纯丙酮一EP0N812包埋剂，室温下放置30min，弃去稀释的包埋剂，加纯包埋剂1ml，室温放置2h；④包埋：把细胞团块移入胶囊膜块孔的底部中心，注满混合包埋剂，放置于60℃烤箱烘烤24h，使之固化成为硬块；⑤...

【专利技术属性】
技术研发人员：白春雨，高玉花，
申请(专利权)人：济宁医学院，
类型：发明
国别省市：山东,37