猪急性腹泻综合征冠状病毒引物组合物及其试剂盒和方法技术

本发明专利技术公开了一种猪急性腹泻综合征冠状病毒引物组合物及其试剂盒和方法；旨在提供一种灵敏度高，特异性强的SADS检测引物和方法，其技术方案包括由正向内引物SADS‑FIP、反向内引物SADS‑BIP、正向外引物SADS‑F3、反向外引物SADS‑B3、正向环引物SADS‑LF和反向环引物SADS‑LB组成；检测方法为：1)样品中提取病毒的RNA；2)以提取的RNA为模板，利用SADS的RT‑LAMP引物组合物，建立RT‑LAMP扩增体系，在60℃‑65℃恒温条件下进行逆转录环介导等温扩增；3)利用DEAOU‑308C恒温荧光检测仪检测；属于生物检测技术领域。

* primer composition for pig acute diarrhea syndrome coronavirus and kit and method thereof

The invention discloses a primer composition of porcine acute diarrhea syndrome coronavirus and a kit and a method thereof, aiming at providing a high sensitivity and specificity SADS detection primer and a method thereof. The technical scheme includes forward-inward primer SADS_FIP, reverse-inward primer SADS_BIP, forward-outward primer SADS_F3 and reverse-outward primer SADS_F3. Composition of SADS_B3, forward-loop primer SADS_LF and reverse-loop primer SADS_LB. Detection methods were as follows: 1) RNA was extracted from the samples; 2) RT_LAMP amplification system was established by using the extracted RNA as template and SADS RT_LAMP primer composition, and RT_LAMP amplification was performed at 60 65 C under constant temperature. It is detected by DEAOU - 308C constant temperature fluorescence detector and belongs to the field of biological detection technology.

【技术实现步骤摘要】
猪急性腹泻综合征冠状病毒引物组合物及其试剂盒和方法
本专利技术公开了一种引物组合物，具体地说，是一种检测猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS)的RT-LAMP引物组合物，本专利技术还公开了检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的试剂盒和方法；属于生物检测

技术介绍
2016年10月底，广东清远一种猪场暴发仔猪致死性疾病，发病仔猪表现为严重急性腹泻、呕吐、体重迅速下降，5日龄以下的仔猪死亡率高达90％。其他三个猪场随后也出现了疫情。截至2017年5月，共造成24693头仔猪死亡。根据临床症状，研究人员对病猪样本进行了猪流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒等已知猪腹泻相关病毒的检测。然而在疾病暴发高峰期，所有病毒检测结果均为阴性，表明该疾病是一种新发疾病。随后，对肠道样本的高通量测序结果、病毒分离和感染实验证实，该疾病的病原是一种冠状病毒，将其命名为猪急性腹泻综合征冠状病毒，简称SADS冠状病毒(swineacutediarrheasyndromecoronavirus,SADS-CoV)。对SADS冠状病毒的基因组序列分析为寻找病毒的来源提供了线索：SADS病毒与2007年香港大学首次发现的蝙蝠冠状病毒HKU2基因组序列高度相似，全长序列一致性达95％，但囊膜蛋白(S蛋白)的氨基酸序列一致性只有86％。这表明HKU2虽不是SADS冠状病毒的直接祖先，但两者在遗传进化上关系相近，暗示SADS冠状病毒来源于蝙蝠。研究团队随即对2013-2016年期间在广东采集的591份蝙蝠样品进行了SADS冠状病毒特异性定量PCR检测，共有58份结果为阳性，阳性样品基本来自菊头蝠。其中一株在发生疫情猪场附近的蝙蝠洞穴中发现的冠状病毒与SADS病毒的全基因组序列一致性高达98.48％，其S蛋白氨基酸序列一致性在98％以上。结果进一步表明引起这次仔猪腹泻疫情的SADS冠状病毒来源于蝙蝠HKU2相关冠状病毒的跨种传播。根据对和病猪有密切接触的猪场工作人员的血清学调查结果，尚无证据显示SADS冠状病毒可进一步跨种感染人。SADS和2002-2003年暴发的严重急性呼吸综合征(SARS)具有诸多相似之处：两者均发生于广东，都由新发冠状病毒引起，源头都是菊头蝠。蝙蝠是多种冠状病毒的自然储存宿主。SADS冠状病毒的检测技术对应该病的疫病防控、保障畜牧业生产安全和流行病学调查具有重要意义。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术的第一个目的是提供一种猪急性腹泻综合征冠状病毒引物组合物；本专利技术的第二个目的是提供一种灵敏度高的检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的试剂盒，本专利技术的第三个目的是检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的方法。为此，本专利技术提供的第一个技术方案是这样的：一种猪急性腹泻综合征冠状病毒引物组合物，包括由正向内引物SADS-FIP、反向内引物SADS-BIP、正向外引物SADS-F3、反向外引物SADS-B3、正向环引物SADS-LF和反向环引物SADS-LB组成；引物SADS-F3核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；引物SADS-B3核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；引物SADS-FIP核苷酸序列如SEQIDNO：3所示；引物SADS-BIP核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；引物SADS-LB核苷酸序列如SEQIDNO：5所示。引物SADS-LF核苷酸序列如SEQIDNO：6所示；本专利技术的第二个技术方案是提供一种猪急性腹泻综合征冠状病毒的RT-LAMP检测试剂盒，该试剂盒含上述的RT-LAMP引物组合物。本专利技术提供的后一个技术方案是一种检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的方法，包括下述步骤：1)从样品中提取病毒的RNA；2)取步骤1)提取的RNA加入到RT-LAMP反应液中混合，建立扩增体系，在60℃-65℃恒温条件下进行环介导等温扩增；3)将SYTO-9加入步骤2)得到的扩增产物中，利用DEAOU-308C恒温荧光检测仪检测。进一步的，上述的一种检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的方法，所述RT-LAMP反应液为：总体积为25μL，反应缓冲液2.5μL；MgSO41.5μL；dNTPMix10mM3.5μL；Primermix1μL；甜菜碱4μL；RNA2.0μL；Bst2.0DNA聚合酶1μL；逆转录酶0.5μL；SYTO-90.5μL。进一步的，上述的一种检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的方法，所述的MgSO4浓度为100mM，dNTPMix浓度为10mM；甜菜碱浓度为5M；逆转录酶浓度为1U/μL；SYTO-9浓度为5mM。进一步的，上述的一种检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的方法，所述的所述的Primermix体系中SADS-OF/SADS-OB、SADS-IF/SADS-IB、SADS-LF/SADS-LB的终浓度分别为：0.2mM、1.6mM、0.8mM。进一步的，上述的一种检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的方法，所述环介导等温扩增程序为63℃扩增1h。与现有技术相比，本专利技术提供的技术方案具有如下技术优点：1、本专利技术提供的技术方案采用逆转录环介导等温扩增(Loop-mediatedisothermalampli-fication,RT-LAMP)技术，依赖于能够识别靶序列上6个特异区域的引物和一种具解旋功能且使靶序列呈环介导等温扩增的BstDNA聚合酶，在等温条件下可高效、快速、特异地扩增靶序列。2、本专利技术提供的技术方案采用RT-LAMP扩增方式为环介导等温扩增，扩增效率高，由于RT-LAMP识别的是核酸上的6个特异性的位点，所以其特异性强。3、本专利技术提供的技术方案RT-LAMP只在60℃-65℃进行恒温扩增，过程不需要昂贵的荧光定量PCR仪，因此非常简便、仪器成本低廉；且由于RT-LAMP是恒温扩增，不需要反转录步骤及PCR仪升降温的时间，所以扩增时间短。4、本专利技术提供的技术方案RT-LAMP反应中加入荧光物质后，合成大量的DNA时，在荧光恒温扩增仪器上可以看到扩增曲线，扩增过程一目了然，且极大地提高了灵敏度。5、本专利技术提供的技术方案设计特异性引物，多病毒验证此方法的特异性，检验了其重复性与稳定性，建立了适用于现场检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的快速检测方法。附图说明图1是RT-LAMP方法建立的曲线；图2是特异性试验曲线；图3是灵敏度试验试验曲线；图4是重复性与稳定性试验曲线；图5是临床样本试验曲线之一；图6是临床样本试验曲线之一。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术的权利要求做进一步的详细说明，对于本申请为详细披露的信息，均按照本领域常规技术手段进行。实施例1本专利技术提供的一种猪急性腹泻综合征冠状病毒引物组合物，包括由正向内引物SADS-FIP、反向内引物SADS-BIP、正向外引物SADS-F3、反向外引物SADS-B3、正向环引物SADS-LF和反向环引物SADS-LB组成；引物SADS-F3核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；引物SADS-B3核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；引物SADS-FIP核苷酸序列如SEQIDNO：3所示；引物SADS-BIP核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；引物SADS-LB核苷酸序列如SEQIDNO：5所示。引物SADS-LF核苷酸序列如SEQIDNO：6所示；实施例2本专利技术的一种SADS的RT-LAMP检测本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪急性腹泻综合征冠状病毒引物组合物，其特征在于，包括由正向内引物SADS‑FIP、反向内引物SADS‑BIP、正向外引物SADS‑F3、反向外引物SADS‑B3、正向环引物SADS‑LF和反向环引物SADS‑LB组成；各引物核苷酸序列如下所示：引物SADS‑F3核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；引物SADS‑B3核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；引物SADS‑FIP核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；引物SADS‑BIP核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；引物SADS‑LB核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。引物SADS‑LF核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

【技术特征摘要】
1.一种猪急性腹泻综合征冠状病毒引物组合物，其特征在于，包括由正向内引物SADS-FIP、反向内引物SADS-BIP、正向外引物SADS-F3、反向外引物SADS-B3、正向环引物SADS-LF和反向环引物SADS-LB组成；各引物核苷酸序列如下所示：引物SADS-F3核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；引物SADS-B3核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；引物SADS-FIP核苷酸序列如SEQIDNO：3所示；引物SADS-BIP核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；引物SADS-LB核苷酸序列如SEQIDNO：5所示。引物SADS-LF核苷酸序列如SEQIDNO：6所示。2.一种检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的试剂盒，其特征在于，该试剂盒含权利要求1所述的RT-LAMP引物组合物。3.一种检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的方法，其特征在于，依次包括下述步骤：1)从样品中提取病毒的RNA；2)以提取的RNA为模板，利用权利要求1)中所述的SADS的RT-LAMP引物组合物，建立RT-LAMP扩增体系，在60℃-65℃恒温条件下进行环介导等温...

【专利技术属性】
技术研发人员：王华南，黄韧，丛锋，曾繁文，郭鹏举，王乐烽，
申请(专利权)人：浙江大学，广东省实验动物监测所，
类型：发明
国别省市：浙江,33