针对赋予膦丝菌素-N-乙酰转移酶抗性的酶的单克隆抗体及检测方法技术

本文描述了用于确定和定量膦丝菌素‑N‑乙酰转移酶(phosphinothricin‑N‑acetyl‑transferase)存在的单克隆抗体和方法。权利要求的抗体和方法特别用于确定和定量在转基因植物中表达的膦丝菌素‑N‑乙酰转移酶的存在。

Monoclonal antibodies and methods for detection of phosphonicin -N- acetyltransferase resistant enzymes

In this paper, the monoclonal antibodies and methods for determining and quantifying the presence of phosphinothricin N acetyl transferase are described. In particular, the antibodies and methods claimed are used to determine and quantify the presence of phosphorothionin N acetyltransferase expressed in transgenic plants.

【技术实现步骤摘要】
针对赋予膦丝菌素-N-乙酰转移酶抗性的酶的单克隆抗体及检测方法本申请是2013年10月9日提交的申请号为201380052572.8(PCT申请号为PCT/US2013/064103)、专利技术名称为“针对赋予膦丝菌素-N-乙酰转移酶抗性的酶的单克隆抗体及检测方法”的专利技术专利申请的分案申请。相关申请的交叉引用本申请要求获得于2012年10月10日提交的美国专利申请系列号61/711,950的权益。
本专利技术涉及的领域是应用于旨在检测由某些转基因植物事件表达的酶的ELISA(酶联免疫吸附测定法)的免疫学，这些酶可赋予对草铵膦，即L-膦丝菌素除草剂的抗性。背景编码膦丝菌素-N-乙酰转移酶(PAT)(EC2.3.1.183)的基因常规地用作植物转基因事件的可选择标记，它们最初是从常见的好氧土壤放线菌——绿色产色链霉菌(Streptomycesviridochromogenes)中分离的。PAT酶催化膦丝菌素的乙酰化，将其脱毒为无活性的化合物，导致氨积累和细胞死亡(MurakamiT.，AnzaiH.，ImaiS.，SatohA.，NagaokaK.，ThompsonC.J.(1986).MolGenGenet205：42-50；TwellD.，KleinT.M.，FrommM.E.，McCormickS.(1989).PlantPhysiol91：1270-1274.)。因此，表达PAT的转化植物细胞能够用草铵膦加以选择。开发并销售用于播种用种子产品(plantingseedproducts)的重组DNA性状(traits)的公司制订、执行并遵守严格的产品管理计划。这些管理计划要求对重组性状的各种组分使用经验证的定量和定性蛋白质检测方法，以跟踪性状渗入和种子产生活性，以及监测谷物收成。这些检测方法必须足够容易使用并且足够鲁棒，以供在GLP和非GLP条件下使用。此外，这些方法必须对用户足够友好，以使农民便于在田间、粮商便于在筒仓、海关官员便于在边境使用。因此，鲁棒、高质量、用户友好的蛋白质检测方法和商业试剂盒是有用的且必要的。尽管ELISA在本领域众所周知，但是开发能够在实验室和田间设置下重复检测一系列植物组织中的特定转基因产物的鲁棒、高质量、经验证的(validated)ELISA方法既不是琐碎小事，亦非常规手段。更具有挑战性的是发现特别适合于开发用于检测功能性PAT转基因事件的侧向流试纸条(lateralflowstrip)和/或ELISA的抗体对(antibodypairs)。专利技术概要本专利技术提供了一组单克隆抗体(mAbs)，155AD4，155E2.1.114，155Q3，155Q12，和155Q19.1，和产生这些mAbs的杂交瘤细胞系。这些mAbs令人惊讶地非常适用于检测多种植物和植物组织中表达PAT的转基因事件。本专利技术进一步提供了使用本专利技术免疫球蛋白的定量和定性免疫测定法，并且一般性地包括用于鉴定PAT酶存在的方法，其包括a)将第一种要求保护的mAb固定在测定表面上，然后清洗所述测定表面；b)使所述测定表面与怀疑含有PAT的液体接触足以容许结合的一段时间，然后清洗所述测定表面；c)使所述测定表面与和报告基团缀合的不同的要求保护的第二种抗体接触一段时间，该接触时间足以容许所述第二种缀合单克隆抗体结合，然后清洗所述测定表面；和d)检测所述报告基团的存在或不存在。本专利技术进一步一般性地包括用于定量测定PAT酶的方法，包括：a)将PAT特异性单克隆抗体固定在测定表面上；b)使所述测定表面与怀疑含有PAT的液体接触足以容许结合的一段时间，然后清洗所述测定表面；c)使所述测定表面与和报告基团缀合的不同的要求保护的第二抗体接触一段时间，该接触时间足以容许所述第二缀合单克隆抗体结合，然后清洗所述测定表面；和d)通过从比较到校准曲线插值来定量所述报告基团的存在。本专利技术还包括使用这些mAbs分离或检测PAT的方法，包括：a)将所述抗体固定化到表面上；b)使所述固定化的抗体与含有PAT的混合物接触；c)从所述混合物中分离与PAT结合的所述固定化抗体；和d)通过从所述固定化抗体中移出与抗体结合的PAT来回收PAT。附图简述图1是ELISA标准曲线分析。纯化的重组PAT蛋白被稀释成7个浓度，范围是0.25-6.0ng/mL。使用450nm的光密度读数减去650nm的背景OD对浓度进行描点绘图。专利技术详细说明本专利技术包括特异性结合PAT的抗体和产生这些mAbs的杂交瘤。下表列出了要求保护的杂交瘤细胞系命名及其相应的保藏日期。杂交瘤/mAb命名ATCC保藏命名ATTC保藏日期155AD4PTA-131882012年9月12日155E2.1.114PTA-131892012年9月12日155Q3PTA-131872012年9月12日155Q12PTA-131902012年9月12日155Q19.1PTA-131862012年9月12日杂交瘤细胞系(分类命名：小鼠(Musmusculus)被保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，美国弗吉尼亚州马纳萨斯市20110-2209(10801UniversityBoulevard,Manassas,VA,20110-2209)，该机构将向公众无限制地发放这些细胞系，但受到专利权管制。要求保护的细胞系以DowAgroSciencesLLC的名义于2012年9月12日保藏。这些保藏物系根据布达佩斯条约中关于用于专利程序目的之细胞系的保藏的相关条款作出并保持。这些保藏物将在ATCC保藏机构，其是一处公共性保藏机构，无限制地保持30年，或者在最近一次请求后5年，或者专利的有效期，以较长者为准，并且如果它们在此期间失活，则将被更换。本专利技术包括使用这些mAbs分离或检测PAT的方法，包括将所述抗体固定化到表面上，使所述固定化的抗体与含有PAT的混合物接触，从所述混合物中分离与PAT结合的所述固定化抗体，和通过从所述固定化抗体中移出与抗体结合的PAT来回收PAT。本专利技术进一步包括使用要求保护的抗体鉴定生物样品中PAT之存在的方法，包括将所述抗体固定化在测定表面上，使所述测定表面与怀疑含有PAT的液体接触并用合适的溶液清洗所述测定表面，使所述测定表面与用报告基团标记的抗-PAT抗体接触并用合适的溶液清洗所述测定表面，和检测所述报告基团的存在。本专利技术进一步包括用于定量确定在转基因植物，特别是玉米、大豆和棉花植物中表达的PAT酶的分析方法。使用磷酸盐缓冲盐水溶液从植物样品中提取PAT蛋白。将提取物离心，收集水性上清液并稀释。在抗-PAT多克隆或单克隆抗体包被的平板的孔中，以夹心ELISA模式，将等份的稀释样品与要求保护的专利技术的酶缀合抗-PAT单克隆抗体进行温育。夹心对中的两种抗体均捕捉样品中的PAT蛋白。在温育期结束时，通过用PBST清洗将未结合的试剂从平板上除去。通过将酶缀合物与酶底物温育，产生有颜色的产物，来检测PAT的存在。因为PAT被结合在抗体夹心中，所以显色水平与样品中PAT的浓度成正比(即，蛋白浓度越低，显色越低)。使用酶标仪测量450nm的吸光度，并减去参考波长(例如650nm)的吸光度。使用二次回归方程从7个标准浓度估算校准曲线。这种PATELISA的特异性和灵敏度足以用于定量植本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种特异性结合膦丝菌素‑N‑乙酰转移酶(PAT)的单克隆抗体，其选自下列单克隆抗体的组：155AD4,155E2.1.114,155Q3,155Q12,和155Q19.1。

【技术特征摘要】
2012.10.10 US 61/711,9501.一种特异性结合膦丝菌素-N-乙酰转移酶(PAT)的单克隆抗体，其选自下列单克隆抗体的组：155AD4,155E2.1.114,155Q3,155Q12,和155Q19.1。2.权利要求1的单克隆抗体，由命名为155AD4的杂交瘤产生。3.权利要求1的单克隆抗体，由命名为155E2.1.114的杂交瘤产生。4.权利要求1的单克隆抗体，由命名为155Q3的杂交瘤产生。5.权利要求1的单克隆抗体，由命名为155Q12的杂交瘤产生。6.权利要求1的单克隆抗体，由命名为155Q19.1的杂交瘤产生。7.一种产生权利要求1的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，其以选自下组的登录号保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)：PTA-13186,PTA-13187,PTA-13188,PTA-13189,和PTA-13190。8.权利要求7的杂交瘤，其以ATCC登录号PTA-13186保藏。9.权利要求7的杂交瘤，其以ATCC登录号PTA-13187保藏。10.权利要求7的杂交瘤，其以ATCC登录号PTA-13188保藏。11.权利要求7的杂交瘤，其以ATCC登录号P...

【专利技术属性】
技术研发人员：G·单，E·H·马，
申请(专利权)人：美国陶氏益农公司，
类型：发明
国别省市：美国,US