本发明专利技术公开了一种胰腺癌痕量DNA富集捕获测序的方法，所述方法包括步骤：(1)从样本中提取游离DNA；(2)将所述游离DNA建文库；(3)将所述文库进行富集；(4)将所述富集的文库进行捕获，获得捕获DNA；(5)将所述捕获DNA测序，获得测序结果；(6)将所述测序结果与参考序列比较，获得突变位点。
A method for enrichment, capture and sequencing of trace DNA in pancreatic cancer and its application
The invention discloses a method for enriching and capturing trace DNA of pancreatic cancer, which comprises steps: (1) extracting free DNA from a sample; (2) constructing a library of the free DNA; (3) enriching the library; (4) capturing the enriched library to obtain the captured DNA; (5) sequencing the captured DNA to obtain the measurement. Sequence analysis; (6) comparing the sequencing results with reference sequences, we obtained mutation sites.
【技术实现步骤摘要】
一种胰腺癌痕量DNA富集捕获测序的方法以及应用
本专利技术属于癌症基因检测领域，更具体而言涉及一种胰腺癌痕量DNA富集捕获测序的方法以及应用。
技术介绍
胰腺癌是消化道常见的恶性肿瘤之一，恶性程度高、预后极差(SiegelR,NaishadhamD,JemalA.Cancerstatistics,2013.CA:acancerjournalforclinicians.2013；63(1):11-30.doi:10.3322/caac.21166.)。全球胰腺癌死亡率为4.2％，位列恶性肿瘤死亡率的第7位，5年生存率不足6％，其中复发和转移是胰腺癌患者死亡的主要原因。目前，临床上通常采用影像学、肿瘤标志物、穿刺活检的方法对胰腺癌进行复发或治疗进展评估。由于胰腺癌乏血供的特性，常规影像学手段均较难发现早期转移灶及局部复发灶，导致影像学表现滞后；CA-199是目前仅有的FDA批准的用于胰腺癌术后监测的指标，但也存在敏感性和特异性的局限(OsayiSN,BloomstonM,SchmidtCM,EllisonEC,MuscarellaP.Biomarkersaspredictorsofrecurrencefollowingcurativeresectionforpancreaticductaladenocarcinoma:areview.BioMedresearchinternational.2014；2014:468959.doi:10.1155/2014/468959.)；大部分胰腺癌患者复发或转移病灶的活检标本难以获得，因此目前缺乏对胰腺癌诊断复发转移的早期监测指标及技术。基于组织样品和外周血样品的基因检测对于胰腺癌早期诊断、手术微小残留检测、晚期用药指导、疗效监测和预后评估具有重要的应用前景(KennerBJ,ChariST,CleeterDF,GoVL.Earlydetectionofsporadicpancreaticcancer:strategicmapforinnovation--awhitepaper.Pancreas.2015Jul；44(5):686-92.doi:10.1097/MPA.0000000000000369.；BettegowdaC,SausenM,LearyRJ.DetectionofCirculatingTumorDNAinEarly-andLate-StageHumanMalignancies.SciTranslMed.2014；6(224):224ra24doi:10.1126/scitranslmed.3007094.)。由于胰腺癌酶活性高、结缔组织丰富等组织特性对胰腺癌样品DNA提取量产生影响，外周血提取的游离肿瘤DNA量通常也较低，不能满足传统分子检测的使用量，如传统的组织基因检测——Sanger测序，往往需要微克级的DNA样品。而基于PCR的方法，往往在一次检测中仅能判断单个基因少数位点的突变情况，如KRAS基因热点突变。如何高效利用来自于脱落细胞、穿刺活检微量样本、外周血游离DNA样本中提取的痕量DNA进行基因检测，是解决胰腺癌分子检测问题的关键。因此，本领域中需要一种利用痕量DNA进行基因检测的技术。
技术实现思路
本专利技术考虑到胰腺组织样品DNA或外周血游离DNA的不易获取的特性，提供了一种低起始量DNA富集捕获测序的方法，以克服原有技术的不足。因此，在第一方面，本专利技术提供了一种胰腺癌痕量DNA富集捕获测序的方法，所述方法包括步骤：(1)从样本中提取游离DNA；(2)将所述游离DNA建文库；(3)将所述文库进行富集；(4)将所述富集的文库使用捕获探针进行捕获，获得捕获DNA；(5)将所述捕获DNA测序，获得测序结果；(6)将所述测序结果与参考序列比较，获得突变位点。在一个实施方案中，步骤(1)中，所述样本选自胰液脱落细胞、穿刺活检样本、唾液、胸腹腔积液、尿液、粪便等。在一个实施方案中，在步骤(3)中进行PCR富集所述文库。所述PCR引物，优选采用高通量测序通用引物。在一个实施方案中，在步骤(4)中捕获探针为针对表3中所列出基因的基因序列的探针。在一个实施方案中，在步骤(4)中捕获探针为针对表4中所列出基因突变的探针。在一个实施方案中，在步骤(4)中捕获探针为针对表5中所列出基因位点的探针。在第二方面，本专利技术提供了一种捕获芯片，所述捕获芯片包括针对表3中所列出基因的基因序列的捕获探针。在一个实施方案中，在步骤(4)中捕获探针为针对表4中所列出基因突变的探针。在一个实施方案中，在步骤(4)中捕获探针为针对表5中所列出基因位点的探针。在第三方面本专利技术提供了用于指示胰腺癌的基因序列组合，所述基因组合包括表3中所列出基因的基因序列。在一个实施方案中，所述基因序列组合包括表4中所列出的基因突变位点。在一个实施方案中，所述基因序列组合包括表5中所列出的基因位点。相对于其他分析方法，本专利技术的方法的优势如下：1)高适用性：相对于传统的Sanger测序方法，本方法仅需要低至10ng的DNA样品即可进行基因检测，增加了分子检测方法在胰腺癌样品中的适用性；2)高通量：结合下一代测序技术和杂交捕获的实验方法，可以同时对多个样品进行检测，并且可以一次性检测胰腺癌相关基因，提供更全面的突变信息；3)高灵活性：相较于传统的分子检测手段，本方法可以实现对单个患者，多时间节点样品，或者多区域样品，进行连续检测，使得检测更加灵活；4)高准确性：通过高深度的测序，可以提高检出突变的敏感性，实现丰度为0.1％突变的准确检出。附图说明通过以下附图对本专利技术进行说明：图1胰腺癌痕量DNA富集捕获测序示意图。具体实施方式本专利技术的目的在于提供一种高效利用胰腺癌患者样品(组织或外周血)进行基因检测的方法，该方法提供了痕量DNA(纳克级)样品的制备方法，并提供了优化的文库构建方法和自主设计的富集芯片对DNA文库进行高效捕获，进一步采用高通量测序的方法对多基因区域进行检测(图1)，可以高效、准确、灵活地评估胰腺癌基因突变状态，并进一步可以对胰腺癌早期诊断、分子靶向用药及复发监测进行评估。在本专利技术中，基因名称均采用NCBI-Gene(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)里的官方命名(OfficialSymbol)。染色体序列的参考序列为GRCh37/hg19(http://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg19/chromosomes/)，本专利技术中涉及的染色体编号及位置也是基于参考序列为GRCh37/hg19。在本专利技术中，单纯检测基因突变位点的方法不涉及疾病的诊断，但与某些基因突变位点相结合的检测基因突变的方法可以用于疾病检测。因此，本专利技术的方法包括非诊断方法。1.捕获探针设计：根据专利技术人工作中的经验积累，将598名胰腺癌患者的突变信息进行整合分析，进行捕获芯片设计，将43个高频基因的外显子区域及5个热点基因的高频外显子区域设计入芯片，如下表。表1：胰腺癌常见突变基因列表2.痕量DNA提取方法2.1胰液脱落细胞DNA提取方法采用ERCP术留置鼻导管收集胰液24小时，收集瓶四周放置冰块。胰液量不低于5ml，保存在-80℃冰箱备用。2.1.1胰液脱落本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种胰腺癌痕量DNA富集捕获测序的方法，所述方法包括步骤：(1)从样本中提取游离DNA；(2)将所述游离DNA建文库；(3)将所述文库进行富集；(4)将所述富集的文库使用捕获探针进行捕获，获得捕获DNA；(5)将所述捕获DNA测序，获得测序结果；(6)将所述测序结果与参考序列比较，获得突变位点。
【技术特征摘要】
1.一种胰腺癌痕量DNA富集捕获测序的方法，所述方法包括步骤：(1)从样本中提取游离DNA；(2)将所述游离DNA建文库；(3)将所述文库进行富集；(4)将所述富集的文库使用捕获探针进行捕获，获得捕获DNA；(5)将所述捕获DNA测序，获得测序结果；(6)将所述测序结果与参考序列比较，获得突变位点。2.权利要求1的方法，步骤(1)中，所述样本选自胰液脱落细胞、穿刺活检样本、唾液、胸腹腔积液、尿液、粪便等。3.权利要求1或2的方法，在步骤(3)中进行PCR富集所述文库。4.权利要求1或2的方法，在步骤(4)中捕获探针为针对表3中所列出基因的基因序...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄东胜，杨柳，胡晓歌，倪超，蒋佳宏，常连鹏，徐亚平，易鑫，杨玲，
申请(专利权)人：浙江省人民医院，北京吉因加科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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