一种降低尼古丁转化率的CYP82E10基因错义突变体M594及其应用制造技术

技术编号:18723747 阅读:41 留言:0更新日期:2018-08-22 00:50
本发明专利技术公开了一种尼古丁转化率的CYP82E10基因错义突变体M594及其应用。所述的降低尼古丁转化率的CYP82E10基因错义突变体M594相对于核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的CYP82E10基因,所述的降低尼古丁转化率的CYP82E10基因错义突变体M594含有的CYP82E10基因序列中342位的C被T取代发生了点突变,所述的降低尼古丁转化率的CYP82E10基因错义突变体M594的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。应用为所述的降低尼古丁转化率的CYP82E10基因错义突变体M594在获得尼古丁低转化率的烟草植株中的应用。本发明专利技术所述的降低尼古丁转化率的CYP82E10基因错义突变体M594获得的云烟87材料中,叶片尼古丁转化率分别比对照下降约55%,显著降低了尼古丁的转化率。

CYP82E10 gene missense mutant M594 and its application to reduce nicotine conversion rate

The present invention discloses a CYP82E10 gene missense mutant M594 of nicotine conversion rate and its application. The missense mutant M594 of the CYP82E10 gene, which reduces nicotine conversion, has a point mutation at 342 of the CYP82E10 gene sequence contained in the missense mutant M594 of the CYP82E10 gene, which reduces nicotine conversion, relative to the CYP82E10 gene shown in the nucleotide sequence SEQ ID NO.1, and has a point mutation at T substitution of the CYP82E10 gene sequence contained in the said CYP82E10 gene mutant M594, The nucleotide sequence of the CYP82E10 gene missense mutant M594, Ding transformation rate, is shown by SEQ ID NO.2. The application of the missense mutant M594 of the CYP82E10 gene, which reduces the nicotine transformation rate, in obtaining tobacco plants with low nicotine transformation rate. In the Yunyan 87 material obtained by the missense mutant M594 of CYP82E10 gene, the nicotine conversion rate of the leaf is reduced by about 55% compared with the control, and the nicotine conversion rate is significantly reduced.

【技术实现步骤摘要】
一种降低尼古丁转化率的CYP82E10基因错义突变体M594及其应用
本专利技术属于遗传工程
,具体涉及一种降低尼古丁转化率的CYP82E10基因错义突变体M594及其应用。
技术介绍
尼古丁(nicotine)、去甲基尼古丁(nornicotine)、假木贼碱(anabasine)、和新烟碱(anatabine)是烟草(Nicotianatobacum)中主要的生物碱,其中尼古丁是首要的生物碱,占生物碱总含量的90-95%,去甲基尼古丁含量通常低于总生物碱的3.5%,是尼古丁通过去甲基化反应转化生成。去甲基尼古丁能够对人体健康产生危害,主要表现在它是卷烟烟气中潜在致癌物质亚硝基去甲基尼古丁(nitrosonornicotine,NNN)的合成前体,可能导致食管癌、口腔癌的发生。去甲基尼古丁也能直接诱导吸烟者血浆中蛋白的异常糖基化,也有研究表明它能与常用类固醇类药物发生共价反应,影响药效和毒性。因此,减少尼古丁转化生成去甲基尼古丁,即降低尼古丁转化率是烟草减害的重要目标。国际上有两种类型的烟草在生产中广泛应用,白肋烟和烤烟,其中白肋烟生产主要在西方发达国家及南美洲,我国主要种植烤烟。白肋烟CYP82E2亚家族的CYP82E4、CYP82E5、CYP82E10基因能够编码具有活性的尼古丁去甲基酶,是尼古丁转化的关键酶。Gavilano等通过RNAi技术抑制白肋烟强“转化株”CYP82E4及其同源基因的表达,去甲基尼古丁合成受到显著抑制,转基因植株的尼古丁转化率最低只有0.8%,甚至低于白肋烟“非转化株”普遍大约3-5%的转化率。Julio等人在1132个EMS诱变突变株中筛选得到10株在CYP82E4基因座发生点突变的烟草,其中无义突变及错义突变株中尼古丁转化率降至极其微量水平。Lewis等人用EMS诱变的方法分别获得了CYP82E4、CYP82E5、CYP82E10发生突变的白肋烟材料,发现CYP82E5、CYP82E10基因突变不影响尼古丁转化率,三个基因同时突变的突变株中尼古丁转化率远远低于对照株。上述研究表明白肋烟中CYP82E4是决定尼古丁转化率的关键基因,CYP82E5、CYP82E10基因无明显影响。烤烟是中式卷烟的主要原料,降低其尼古丁转化率进而降低NNN含量对中式卷烟减害有重要意义。但迄今为止关于烤烟去甲基尼古丁合成的研究较少,烤烟与白肋烟的合成机制是否一致目前尚无文献报道,如何降低烤烟尼古丁转化率仍需探索。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种降低尼古丁转化率的CYP82E10基因错义突变体M594;第二目的在于提供所述的降低尼古丁转化率的CYP82E10基因错义突变体M594的应用。本专利技术的第一目的是这样实现的,所述的降低尼古丁转化率的CYP82E10基因错义突变体M594相对于核苷酸序列为SEQIDNO.1所示的CYP82E10基因,所述的降低尼古丁转化率的CYP82E10基因错义突变体M594含有的CYP82E10基因序列中342位的C被T取代发生了点突变,所述的降低尼古丁转化率的CYP82E10基因错义突变体M594的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术的第二目的是这样实现的,所述的降低尼古丁转化率的CYP82E10基因错义突变体M594在获得尼古丁低转化率的烟草植株中的应用。本专利技术所述的降低尼古丁转化率的CYP82E10基因错义突变体M594获得的云烟87材料中,叶片尼古丁转化率分别比对照下降约55%,显著降低了尼古丁的转化率。附图说明图1为CYP82E10基因突变毛细管电泳检测;图2为突变体材料M594测序结果比对;图3为突变体材料的测序峰图;图4为突变体材料尼古丁转化率分析。具体实施方式下面结合实施例和附图对本专利技术作进一步的说明,但不以任何方式对本专利技术加以限制,基于本专利技术教导所作的任何变换或替换,均属于本专利技术的保护范围。本专利技术所述的降低尼古丁转化率的CYP82E10基因错义突变体M594相对于核苷酸序列为SEQIDNO.1所示的CYP82E10基因,所述的降低尼古丁转化率的CYP82E10基因错义突变体M594含有的CYP82E10基因序列中342位的C被T取代发生了点突变,所述的降低尼古丁转化率的CYP82E10基因错义突变体M594的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。所述的降低尼古丁转化率的CYP82E10基因错义突变体M594编码的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。本专利技术所述降低尼古丁转化率的CYP82E10基因错义突变体M594的应用为所述的降低尼古丁转化率的CYP82E10基因错义突变体M594在获得尼古丁低转化率的烟草植株中的应用。实施例1烤烟突变体库创制一、烤烟种子EMS处理烤烟(品种:云烟87)种子用50%的市售商品漂白液浸泡12分钟后,用去离子水快速清洗,并在去离子水中浸泡12小时。弃去离子水,加入等体积0.5%EMS(甲基磺酸乙酯)处理12小时。弃处理液,加入去离子水清洗6-8次,每次约1分钟。种子收集于布氏漏斗,抽干待用。二、M1植株田间种植EMS处理完毕种子播种于漂浮盘,每穴一粒种子,出苗后移栽至田间,正常农艺措施管理。现蕾后单株套袋编号收种获得M2种子。三、突变体基因组DNA提取及混样利用试剂盒提取基因组DNA,步骤如下:称取0.1g鲜样,液氮研磨、细碎后,转入2.0ml样品管中,立即加入600μLAP1缓冲液和4μLRNaseA贮存液(100mg/ml)。65℃中水浴处理10分钟,期间颠倒EP管2-3次。加入190μLAP2缓冲液,混匀置于冰上5分钟,14000rpm室温离心5分钟。吸取上清液至QIAshredderMini柱,14000rpm室温离心2分钟。取450—650μL过滤液至2.0ml离心管中,再加入675-900μL的缓冲液AP3/E。取650μL混合物至2ml的DNeasy柱内,室温以≥8000rpm离心1-2分钟。将上述的DNeasy柱放入新的2ml收集管中,加入500μLAW缓冲液,以≥8000rpm离心2分钟,丢弃流出液,再用AW缓冲液重复清洗一次。将DNeasy柱放在1.5ml离心管中,加入100μLAE缓冲液,室温放置5分钟,离心所得滤液即为基因组DNA。大田种植约2200份M2代EMS突变体植株,采集叶片并利用上述方法提取基因组DNA,将所有样品DNA浓度稀释至40ng/μl,最终建立M2代云烟87突变体的DNA库,每8份DNA混样,构成8倍混合池,保存于96孔板中。实施例2CYP82E10基因突变体筛选一、Tilling引物CYP82E10基因有两个外显子,利用Tilling技术筛选第一个外显子区域的突变体。根据目地基因的基因组序列,正向引物为CYP82E10_Tilling_F:GTCAAATACCACCTCTTAATAGTAA,反向引物为CYP82E10_Tilling_R:AAAAGTCCCTATTGGTAGGAAGTGC。二、PCR扩增条件PCR反应体系如下:总体积为10μL,其中20ng/μLDNA样品1.0μL、10×PCRbuffer1.0μL,dNTPs0.8μL,引物各0.16μL,TaqDNA酶0.1μL,ddH2O6.78μL。PCR反应程序如下:95℃预变性3分本文档来自技高网
...

【技术保护点】
1.一种降低尼古丁转化率的CYP82E10基因错义突变体M594,其特征在于所述的降低尼古丁转化率的CYP82E10基因错义突变体M594相对于核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的CYP82E10基因,所述的降低尼古丁转化率的CYP82E10基因错义突变体M594含有的CYP82E10基因序列中342位的C被T取代发生了点突变,所述的降低尼古丁转化率的CYP82E10基因错义突变体M594的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种降低尼古丁转化率的CYP82E10基因错义突变体M594,其特征在于所述的降低尼古丁转化率的CYP82E10基因错义突变体M594相对于核苷酸序列为SEQIDNO.1所示的CYP82E10基因,所述的降低尼古丁转化率的CYP82E10基因错义突变体M594含有的CYP82E10基因序列中342位的C被T取代发生了点突变,所述的降低尼古丁转化率的CYP82E10基因错义突变体M594的核苷酸序列如SEQI...

【专利技术属性】
技术研发人员:李文正宋中邦李梅云王丙武高玉龙吴兴富隋学艺赵璐李永平
申请(专利权)人:云南省烟草农业科学研究院
类型:发明
国别省市:云南,53

网友询问留言 已有0条评论
  • 还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。

1