一种提高文库构建试剂稳定性的方法技术

本发明专利技术提供一种提高文库构建试剂稳定性的方法，具体涉及基因测序技术领域，将文库构建所需要的工具酶进行如下步骤处理，S1：将工具酶进行纳米胶囊封装保存，封装的方法包括原位聚合封装方法和通过电荷吸附的自交联的封装中的一种；S2：使用时，加入降解交联剂的化学试剂，使工具酶具有活性。本发明专利技术使文库构建试剂盒能够在常温下保存，减少物流仓储的成本，同时保存酶活性的稳定，能够在常温下保存12个月。

A method to improve the stability of Library reagents

The invention provides a method for improving the stability of a library construction reagent, in particular relating to the technical field of gene sequencing. The tool enzyme needed for library construction is processed in the following steps: S1: nanocapsule encapsulation and preservation of the tool enzyme, encapsulation method including in-situ polymerization encapsulation method and self-crosslinking through charge adsorption. S2: When used, chemical reagents for degrading crosslinking agents are added to make tool enzymes active. The library construction kit can be stored at room temperature, reduce the cost of logistics storage, and keep the stability of enzyme activity, and can be stored at room temperature for 12 months.

【技术实现步骤摘要】
一种提高文库构建试剂稳定性的方法
本专利技术属于基因测序
，具体涉及一种提高文库构建试剂稳定性的方法。
技术介绍
环境对文库构建试剂稳定性影响最大的是工具酶，工具酶的本质是蛋白质，它们对于外界的环境如温度、pH等同样十分敏感，外界因素极易影响氨基酸残基和蛋白质二级结构从而导致蛋白分子结构的改变以及活性的丢失或丧失。因此，文库构建试剂的工具酶需要低温保存，这无疑增大了物流仓储的成本，同时使用过程中反复冻融降低酶的活性。因此急需一种提高文库构建试剂稳定性的方法，使其能够在常温下保存，减少物流仓储的成本，同时保存酶活性的稳定。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种提高文库构建试剂稳定性的方法，使其能够在常温下保存，减少物流仓储的成本，同时保存酶活性的稳定。本专利技术提供了如下的技术方案：一种提高文库构建试剂稳定性的方法，将文库构建所需要的工具酶进行如下处理：S1：将工具酶进行纳米胶囊封装保存，封装的方法包括原位聚合封装方法和通过电荷吸附的自交联的封装中的一种；S2：使用时，加入降解交联剂的化学试剂，破坏纳米胶囊使工具酶具有活性。优选的，将步骤S1中所述的工具酶进行封装后，得到液体产品与工具酶反应所需要的Buffer液按一定比例混合进行冻干处理得到冻干粉，保存待用。优选的，步骤S1中所述的原位聚合封装方法如下：1)：加一定量的N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺到工具酶中，使工具酶被N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺丙烯酰化；2)：以过硫酸铵和N,N,N`,N`-四甲基乙二胺为引发剂，加入一定量的引发剂到步骤1)中所得到的丙烯酰化的工具酶的表面引发自由基聚合；3)：加入一定量的N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺、丙烯酰胺和交联剂的混合物到步骤2)中所得到的反应物中，反应时间大于60分钟，得到纳米胶囊包裹的工具酶，其中交联剂为二甲基丙烯酸甘油酯和双(2-甲基丙烯)乙氧基二硫中的一种；4)：用凝胶过滤柱分离纯化得到包裹有纳米胶囊的成品工具酶。优选的，使用交联剂是二甲基丙烯酸甘油酯时，则使交联剂降解的化学试剂是低pH的缓冲液；使用交联剂是双(2-甲基丙烯)乙氧基二硫时，则使交联剂降解的化学试剂是DTT(二硫苏糖醇)。优选的，N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺、丙烯酰胺和交联剂的混合物的混合摩尔比是3:7:1。优选的，步骤S1中所述的通过电荷吸附的自交联的封装方法如下：第一步：通过加入pH为8.0-8.5的溶液使工具酶带负电荷；第二步：富含正电荷基团的高分子聚合物和琥珀酰亚胺酯修饰聚乙二醇以一定比例混合一段时间后，清洗分离，可得部分正电荷基团被聚乙二醇化的高分子聚合物；第三步：再在第二步所得的聚合物中加入一定量的特劳特试剂，反应一段时间后，得含有巯基、聚乙二醇和正电荷基团修饰的高分子聚合物；第四步：将第三步所得的高分子聚合物和第一步所得的带有负电荷的工具酶以一定的比例混合，正负电荷吸引形成聚合物包裹负载蛋白的纳米胶囊，再向其中通入氧气，一段时间后，聚合物表面巯基之间相互作用形成二硫键，紧固了纳米胶囊，形成自我交联的纳米胶囊；第五步：用凝胶过滤柱分离纯化得到包裹有纳米胶囊的工具酶。本专利技术的有益效果是：使其能够在常温下保存，减少物流仓储的成本，同时保存酶活性的稳定，能够在常温下保存12个月。具体实施方式实施例1将文库构建所需要的工具酶包括Endrepairing试剂、A-tailing试剂和Ligation试剂中的酶进行原位聚合封装，具体步骤如下：1)：加一定量的N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺到工具酶中，使工具酶被N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺丙烯酰化；2)：以过硫酸铵和N,N,N`,N`-四甲基乙二胺为引发剂，具体是加入0.2mg过硫酸铵(最终得到约100mg/mL的溶液)和0.4μLN,N,N`,N`-四甲基乙二胺到步骤1)中所得到的丙烯酰化的工具酶的表面引发自由基聚合；3)：加入一定量的N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺、丙烯酰胺和交联剂摩尔比为3:7:1的混合物到步骤2)中所得到的反应物中，反应时间大于60分钟得到纳米胶囊包裹的工具酶，其中交联剂为二甲基丙烯酸甘油酯和双(2-甲基丙烯)乙氧基二硫中的一种；4)：用凝胶过滤柱分离纯化得到包裹有纳米胶囊的成品工具酶。5)：取一定量的步骤4)得到的酶溶液与酶反应所需的Buffer液冻干，以冻干粉形式在常温保存。实施例21)通过加入pH为8.0-8.5的溶液使工具酶带负电荷；2)将富含正电荷基团的壳聚糖和聚乙二醇硬脂酸盐以摩尔比1∶6的比例混合，一段时间后清洗分离，可得部分正电荷基团被聚乙二醇化的壳聚糖；3)再以1∶5的摩尔比在上述的聚乙二醇化壳聚糖中加入特劳特试剂，反应一段时间后，得含有巯基、聚乙二醇和正电荷基团修饰的壳聚糖；4)将上述高分子聚合物和带负电荷的增强型绿色荧光蛋白以一定的比例混合，正负电荷吸引形成聚合物包裹增强型绿色荧光蛋白的纳米胶囊，再向其中通入氧气，一段时间后，聚合物表面巯基之间相互作用形成二硫键，紧固了纳米胶囊，形成自交联的纳米胶囊；5)用凝胶过滤柱分离纯化得到包裹有纳米胶囊的工具酶；6)取一定量的第四步得到的酶溶液与酶反应所需的Buffer液冻干，以冻干粉形式在常温保存。实施例3取一定量的实施例1的酶冻干粉加入化学试剂去除交联剂，测试酶活性。使用交联剂是二甲基丙烯酸甘油酯时，则使交联剂降解的化学试剂是低pH的缓冲液；使用交联剂是双(2-甲基丙烯)乙氧基二硫时，则使交联剂降解的化学试剂是DTT(二硫苏糖醇)。取实施例2的酶加入低ph的缓冲溶液，破坏纳米胶囊，使工具酶具有活性，测试酶活性。具体实验方法如下：实施例1和实施例2的工具酶，使其常温放置0天、6个月和12个月(也可以做更多的梯度)，然后与未做处理的工具酶对比做实验，测量酶活性，结果实施例1方法得到的工具酶，12个月内活性保持稳定，实施例2方法得到的工具酶，12个月内活性保持稳定，且2种方法获得的酶的活性略低于未做处理的工具酶的活性，但不影响实验效果。以上所述仅为本专利技术的优选实施例而已，并不用于限制本专利技术，尽管参照前述实施例对本专利技术进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本专利技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本专利技术的保护范围之内。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高文库构建试剂稳定性的方法，其特征在于，将文库构建所需要的工具酶进行如下步骤处理：S1：将工具酶进行纳米胶囊封装保存，封装的方法包括原位聚合封装方法和通过电荷吸附的自交联的封装中的一种；S2：使用时，加入降解交联剂的化学试剂，破坏纳米胶囊使工具酶具有活性。

【技术特征摘要】
1.一种提高文库构建试剂稳定性的方法，其特征在于，将文库构建所需要的工具酶进行如下步骤处理：S1：将工具酶进行纳米胶囊封装保存，封装的方法包括原位聚合封装方法和通过电荷吸附的自交联的封装中的一种；S2：使用时，加入降解交联剂的化学试剂，破坏纳米胶囊使工具酶具有活性。2.根据权利要求1所述的提高文库构建试剂稳定性的方法，其特征在于，将步骤S1中所述的工具酶进行封装后，得到液体产品与工具酶反应所需要的Buffer液按一定比例混合进行冻干处理得到冻干粉，保存待用。3.根据权利要求1或2所述的提高文库构建试剂稳定性的方法，其特征在于，步骤S1中所述的原位聚合封装方法如下：1)：加一定量的N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺到工具酶中，使工具酶被N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺丙烯酰化；2)：以过硫酸铵和N,N,N`,N`-四甲基乙二胺为引发剂，加入一...

【专利技术属性】
技术研发人员：金晶，王西龙，
申请(专利权)人：南京迪格诺斯生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32