人血清白蛋白与人突变型肝细胞生长因子的融合蛋白及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开人血清白蛋白与人突变型肝细胞生长因子的融合蛋白及其制备方法和应用，所述融合蛋白包括人血清白蛋白HSA组成的第一区和人突变型肝细胞生长因子HGF组成的第二区，所述人突变型肝细胞生长因子是指肝细胞生长因子第494位的氨基酸R突变成N、D、K、Q或G。本发明专利技术利用不经过蛋白水解酶作用就具有生物学活性的HGF突变体制备HSA‑HGF融合蛋白，该融合蛋白保持了人肝细胞生长因子生物活性基础上，提高了其在CHO系统中的表达量，简化了分离纯化操作。本发明专利技术的融合蛋白在保持了人肝细胞生长因子的生物活性前提下延长了其在体内的半衰期，提高了HGF的表达量，在药学领域有很好的应用前景。

Fusion protein of human serum albumin and human mutant hepatocyte growth factor and preparation method and application thereof

The invention discloses a fusion protein of human serum albumin and human mutant hepatocyte growth factor, and a preparation method and application thereof. The fusion protein comprises a first region of human serum albumin HSA and a second region of human mutant hepatocyte growth factor HGF. The human mutant hepatocyte growth factor refers to hepatocyte growth. The amino acid R of factor 494th is mutated into N, D, K, Q or G. The HSA_HGF fusion protein is prepared by using the HGF mutant with biological activity without the action of proteolytic enzymes. The fusion protein maintains the biological activity of human hepatocyte growth factor, improves its expression in the CHO system, and simplifies the separation and purification operation. The fusion protein of the invention prolongs the half-life of the human hepatocyte growth factor in vivo while maintaining the biological activity of the human hepatocyte growth factor, improves the expression level of HGF, and has a good application prospect in the pharmaceutical field.

【技术实现步骤摘要】
人血清白蛋白与人突变型肝细胞生长因子的融合蛋白及其制备方法和应用
本专利技术属于长效融合蛋白药物
，更具体地讲，涉及人血清白蛋白与人突变型肝细胞生长因子的融合蛋白及其制备方法。
技术介绍
人血清白蛋白(humanserumalbumin,HSA)是人血浆中最丰富的蛋白质，占血浆总蛋白的60％左右。成熟的HSA由585个氨基酸组成，分子量为66.5kDa，含有17对二硫键，一般为单链无糖基化蛋白质。在正常情况下，不易被肾小球滤过，血浆半衰期在20天左右。HSA广泛用于血浆容量扩充剂，还可作为赋形剂和稳定剂，用于各种药物制剂及无血清培养基的组分。HSA是一种稳定的惰性蛋白，能作为药物载体，赋予药物更好的理化特性。同时，HSA在人体内没有酶学和免疫学活性，是一种理想的生物活性蛋白载体。当目的多肽与HSA融合表达时，不仅可以提高多肽药物的表达量，还可以提高多肽药物的稳定性。肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor,HGF)是生长发育过程中必须的一种活性蛋白物质，具有促进肝细胞生长及肝脏发育效应，主要由肝脏产生和分泌。80年代，T.Nakamura等首先从部分肝切除大鼠的血清中发现一种可以促进肝细胞增殖的蛋白质，并命名为肝细胞生长因子。肝细胞生长因子作为一种多功能生长因子，主要由肝脏的储脂细胞生成，它不仅能够刺激肝细胞DNA的合成，参与多种细胞的增殖、迁移和形态发生，对多种成熟的器官/组织有修复作用。HGF在体内以单链前体被合成和分泌，在蛋白水解酶作用下水解成有活性的双链分子。成熟的HGF是由一个69kDaα链和34kDaβ链组成的异二聚体。单链HGF也能与受体c-Met高亲和力结合，但是不能激活受体，不具有生物学活性。HGF基因是一种多功能基因，正常情况下，HGF/c-Met只是短暂的激活，产与正常胚胎形成、组织再生、创伤修复以及血管生成等。当机体肾脏、肝脏或心脏损伤时，HGF/c-Met基因表达均上调，暗示了HGF的保护作用，在组织损伤时维持体内的平衡。作为一种多功能生长因子，HGF不仅能够刺激肝细胞DNA的合成，还参与多种细胞的增殖、迁移和形态发生，对多种成熟的器官/组织有修复作用。HGF作用于唯一受体c-MET，HGF与c-Met结合后，催化c-Met发生自身磷酸化，磷酸化后其酪氨酸激酶活性增强，导致多种底物蛋白如PLC-r、PI3-K、Gab1、Grb2、STAT3和SHP2等的酪氨酸残基磷酸化。这些底物蛋白经不同的信号通路发挥多种生物学活性，如细胞增值、血管生成、细胞迁移、细胞凋亡等。此外，HGF单体在体内的半衰期较短，只有3-5分钟，如此短的半衰期需要大剂量或者反复注射，导致治疗成本增加与治疗过程困难，融合蛋白HSA-HGF提高了实际应用的竞争力。中国仓鼠卵巢细胞(ChineseHamsterOvary，CHO)是1957年美国科罗拉多大学Dr.TheodoreT.Puck从一成年雌性仓鼠卵巢分离获得，为上皮贴壁型细胞，是生物工程上广泛使用的细胞系。全世界批准正式应用于人类疾病治疗或预防的基因工程产品约30多种，其中只有一种(乙肝疫苗)是由酵母菌生产的，其余所有产品都是由CHO细胞和大肠杆菌生产的。大肠杆菌易于操作，产量高，成本低，但其生产的药物蛋白无糖基化，不能形成有活性的二聚体，在人体内易被降解，且易产生内毒素及包涵体问题。CHO细胞属于成纤维细胞，是非分泌型细胞，由于自身很少分泌内源蛋白，因此可以简化目的蛋白分离纯化操作，能在无血清培养基中高效生产重组药物蛋白，是表达生物大分子的理想宿主。已广泛应用于抗体、基因重组药物、病毒疫苗等生物技术产品的研发与生产。血清的成分十分复杂，除含有促生长的活性成分外，还含有一定的细胞毒性物质和抑制物质，对细胞有去分化作用，影响细胞功能的表达，同时其复杂成分也给基因工程下游工作带来很大困难。因此成分明确，价格经济的无血清培养基成为CHO培养的必然要求。CHO细胞能在无血清培养基中悬浮生长，简化了下游分离纯化操作，降低了生产成本。HGF单体在CHO中表达量较低，通过白蛋白融合技术，实现了在CHO中的高分泌表达，获得具有生物活性且高度稳定的HSA-HGF。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供人血清白蛋白与人突变型肝细胞生长因子的融合蛋白。本专利技术的第二个目的在于提供人血清白蛋白与人突变型肝细胞生长因子的融合蛋白的制备方法。本专利技术的第三个目的在于提供人血清白蛋白与人突变型肝细胞生长因子的融合蛋白的应用。为实现本专利技术第一个目的，本专利技术公开以下技术方案：人血清白蛋白与人突变型肝细胞生长因子的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括人血清白蛋白HSA组成的第一区和人突变型肝细胞生长因子HGF组成的第二区，人血清白蛋白的C末端与人突变型肝细胞生长因子的N末端连接，所述人突变型肝细胞生长因子是指肝细胞生长因子第494位的氨基酸R突变成N、D、K、Q或G。作为一个优选方案，所述人突变型肝细胞生长因子是指肝细胞生长因子第494位的氨基酸R突变成N。为实现本专利技术第二个目的，本专利技术公开以下技术方案：人血清白蛋白与人突变型肝细胞生长因子的融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)利用重叠PCR技术，将人肝细胞生长因子HGF第494位的氨基酸R突变成N、D、K、Q或G，得到不经过酶切就具有生物学活性的HGF突变体；(2)利用重叠PCR技术，连接HSAcDNA和步骤(1)获得的HGF突变体cDNA，中间添加肠激酶酶切位点，得到的HSA-HGF融合蛋白基因插入到表达载体，然后将重组载体转化至宿主细胞CHO中表达，从表达产物中分离纯化获得所述融合蛋白。作为一个优选方案，步骤(1)中将人肝细胞生长因子HGF第494位的氨基酸R突变成N。作为一个优选方案，所述表达载体为pMH3。作为一个优选方案，所述宿主细胞为CHO-KS细胞。作为一个优选方案，所述转化是指利用电穿孔法转化至宿主细胞。作为一个优选方案，所述分离纯化采用的是离子交换层析和亲和层析，所述离子交换层析填料为SPSepharoseFastFlow，所述亲和层析采用的是亲和层析柱，填料为肝素SepharoseFastFlow。为实现本专利技术第三个目的，本专利技术公开以下技术方案：人血清白蛋白与人突变型肝细胞生长因子的融合蛋白在制备治疗肝脏纤维化、肝脏术后修复、肝脏弥漫性损伤药物中的应用。HGF在体内以无活性单链前体被合成和分泌，在蛋白水解酶作用下水解成有活性的双链分子，通过重叠PCR技术，以人HGF为模板，获得不经过蛋白水解酶作用就具有生物学活性的HGF突变体；再利用重叠PCR技术，连接HGF突变体cDNA和HAScDNA，得到的HSA-HGFcDNA，融合蛋白基因通过EcoRI和NotI插入到pMH3表达载体中，电转入CHO-KS细胞中，HSA-HGF融合基因被整合到宿主染色体中进行表达。本专利技术优选动物细胞表达系统，该系统能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的糖基化等多种翻译后修饰功能，表达产物最接近天然的高等生物蛋白大分子。更优选的是CHO表达系统，具有产物外泌功能，很少分泌自身内源蛋白，便于下游分离纯化；能够高效扩增和表达重组基因，可以进行悬浮培养，表达水平较高。更优选的是CHO-KS细胞，既能贴壁本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.人血清白蛋白与人突变型肝细胞生长因子的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括人血清白蛋白HSA组成的第一区和人突变型肝细胞生长因子HGF组成的第二区，人血清白蛋白的C末端与人突变型肝细胞生长因子的N末端连接，所述人突变型肝细胞生长因子是指肝细胞生长因子第494位的氨基酸R突变成N、D、K、Q或G。

【技术特征摘要】
1.人血清白蛋白与人突变型肝细胞生长因子的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括人血清白蛋白HSA组成的第一区和人突变型肝细胞生长因子HGF组成的第二区，人血清白蛋白的C末端与人突变型肝细胞生长因子的N末端连接，所述人突变型肝细胞生长因子是指肝细胞生长因子第494位的氨基酸R突变成N、D、K、Q或G。2.根据权利要求1所述的人血清白蛋白与人突变型肝细胞生长因子的融合蛋白，其特征在于，所述人突变型肝细胞生长因子是指肝细胞生长因子第494位的氨基酸R突变成N。3.权利要求1所述人血清白蛋白与人突变型肝细胞生长因子的融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)利用重叠PCR技术，将人肝细胞生长因子HGF第494位的氨基酸R突变成N、D、K、Q或G，得到不经过酶切就具有生物学活性的HGF突变体；(2)利用重叠PCR技术，连接HSAcDNA和步骤(1)获得的HGF突变体cDNA，中间添加肠激酶酶切位点，得到的HSA-HGF融合蛋白基因插...

【专利技术属性】
技术研发人员：张雁云，金坚，徐栋生，万爱妮，陈蕴，金敏，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院，江南大学，
类型：发明
国别省市：上海,31