本发明专利技术涉及一种用于研究细菌中类泛素系统的试剂盒及其应用，属于生物学技术领域。本发明专利技术的试剂盒包括ThiS蛋白和ThiF蛋白，还可以包括MgCl2和Tris‑HCl反应缓冲液、DTT和ATP。ThiF蛋白具有连接酶的功能，在体外，在存在ATP时，可以将ThiS蛋白连接到底物蛋白上，形成类泛素化修饰，并且这种类泛素化修饰具有底物选择性，FtsA和PriC能够被ThiS蛋白和ThiF蛋白修饰，而MoaC不能。本发明专利技术的试剂盒可以有效的研究底物的类泛素化修饰情况，方便快捷效率高。
A kit for studying ubiquitin like system in bacteria and its application
The invention relates to a reagent kit for studying ubiquitin-like system in bacteria and its application, belonging to the biological technology field. The kit of the invention includes ThiS protein and ThiF protein, and can also include MgCl2 and Tris_HCl reaction buffer, DTT and ATP. ThiF protein has the function of ligase. In vitro, in the presence of ATP, ThiS protein can be linked to substrate proteins to form ubiquitination-like modifications, and this ubiquitination-like modification has substrate selectivity. FtsA and PriC can be modified by ThiS protein and ThiF protein, but MoaC can not. The kit of the invention can effectively study the ubiquitination modification of the substrate, and is convenient, fast and efficient.
【技术实现步骤摘要】
一种用于研究细菌中类泛素系统的试剂盒及其应用
本专利技术涉及一种用于研究细菌中类泛素系统的试剂盒及其应用，属于生物学
技术介绍
大肠杆菌类泛素蛋白ThiS是分子量7.2kDa的小分子蛋白，它的结构与泛素蛋白非常相似，它们都有五个β折叠片，两个α螺旋，之前研究发现它参与维生素B1的合成(Iyer,L.M.,Burroughs,A.M.&Aravind,L.Theprokaryoticantecedentsoftheubiquitin-signalingsystemandtheearlyevolutionofubiquitin-likeβ-graspdomains.GenomeBiology7,91-96(2006))。在体内ThiS和ThiF蛋白主要参与维生素B1的合成，ThiF能够将ThiSC末端的两个GG活化，随后参与硫转运过程，ThiF蛋白在维生素B1合成时，主要功能是腺苷酰化ThiS蛋白(激活功能)，能够将ThiS携带的硫转运给下游蛋白，ThiF蛋白与泛素系统的E1激活酶类似(Lehmann,C.,Begley,T.P.&Ealick,S.E.StructureoftheEscherichiacoliThiS-ThiFcomplex,akeycomponentofthesulfurtransfersysteminthiaminbiosynthesis.Biochemistry45,11-19(2006),Xibing,X.etal.Heatshocktranscriptionfactorδ(32)istargetedfordegradationviaanubiquitin-likeproteinThiSinEscherichiacoli.Biochemical&BiophysicalResearchCommunications459,240-245(2015))。目前，通过基因工程技术，微生物可以高效地将可再生碳水化合物转化为各种有用产品，如柠檬酸、维生素、氨基酸、溶剂、抗生素、酶制剂、生物杀虫剂、生物染色剂、生物表面活性剂、生物碱、类固醇等等，对国民经济所作的贡献令人瞩目。而这些产物的合成往往涉及各种酶的参与，研究微生物蛋白质(包括酶)翻译后修饰为提高代谢产物的产量提供理论依据，泛素化修饰即为一种重要的翻译后修饰过程。大肠杆菌是常用的基因工程菌株，其遗传背景清楚，技术操作简单，培养条件简单，可以实现大规模发酵经济，因此倍受遗传工程专家的重视。例如利用大肠杆菌能够表达人胰岛素，抗菌蛋白等，但是在表达外源蛋白时其表达量和可溶性往往较差，目前有研究发现在胰岛素的N末端融合类泛素蛋白ThiS，能够提高其可溶性，但是原因不清楚(Yuan,S.,etal.,Prokaryoticubiquitin-likeThiSfusionenhancestheheterologousproteinoverexpressionandaggregationinEscherichiacoli.PloSone,2013.8(4):p.e62529)。为了扩展ThiS蛋白的应用范围，需要对ThiS蛋白在体外类泛素系统的作用加以研究。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于研究细菌中类泛素系统的试剂盒，该试剂盒可以方便的用于底物蛋白的体外泛素化研究。本专利技术还提供了上述试剂盒在研究体外类泛素化系统中的应用。为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种用于研究细菌中类泛素系统的试剂盒，包括ThiS蛋白和ThiF蛋白，或者包括用于表达ThiS蛋白和ThiF蛋白的载体或菌种；所述ThiS蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，ThiF蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。优选的，ThiS蛋白的N末端含有用于westernblot检测的标签，例如Flag标签。本专利技术中的ThiS与ThiF蛋白在体外能够共价连接，实验研究发现，ThiS能够共价连接到ThiF上，ThiF作为一种激活酶，很可能与古细菌的类似蛋白一样，具有连接酶的功能。因此，本专利技术将ThiS与ThiF蛋白制备成一种试剂盒，用于体外类泛素化系统的研究。具体的，所述ThiS蛋白的使用浓度为0.15-0.25μg/μL。在该浓度下，能够满足底物修饰的需要。优选的，ThiS蛋白的使用浓度为0.2μg/μL。在实际的试剂盒制备过程中，ThiS蛋白和ThiF蛋白可以制备为高浓度的母液，优选为1mg/mL。上述的试剂盒，还包括反应缓冲液、DTT和/或ATP，所述反应缓冲液中包括MgCl2和Tris-HCl。其中反应缓冲液为泛素化反应提供反应环境，DTT可以避免ThiF氧化失活，ATP为泛素化反应提供能量。所述反应缓冲液中MgCl2和Tris-HCl的摩尔浓度比为2.3-2.7：45-55，优选的，摩尔浓度比为1-20。所述反应缓冲液中MgCl2的使用浓度为2.3-2.7mmol/L，优选为2.5mmol/L。Tris-HCl的使用浓度为45-55mmol/L，优选为50mmol/L，pH为7.5。在实际的试剂盒制备过程中反应缓冲液可以制备为20x、10x、5x或其他浓缩倍数的母液，在使用时添加H2O补至使用浓度。优选的，配置成5x的母液，Tris-HCl的浓度优选为250mM，MgCl2的浓度优选为12.5mM，pH7.5。反应缓冲液命名Reactionbuffer。所述ATP的使用浓度为3.5-4.5mmol/L，优选为4mmol/L。在实际的试剂盒制备过程中，ATP可以制备为高浓度的母液，优选为1M。所述DTT的使用浓度为0.5-1.5mmol/L，优选为1mmol/L。在实际的试剂盒制备过程中，DTT可以制备为高浓度的母液，优选为100mM。所述ThiS蛋白和ThiF蛋白由基因工程的方法制备得到，具体为：将thiS基因和thiF基因分别克隆到表达载体pET28-a中，转化到大肠杆菌中，诱导表达、纯化即得。thiS的N末端加上Flag标签，有利于后续的westernblot检测。pET28-a表达载体上带有His6标签，因此表达的ThiS和ThiF都带有His6标签。所述用于表达ThiS蛋白和ThiF蛋白的载体中包含thiS基因和/或thiF基因。所述thiS基因如SEQIDNO.3所示，所述thiF基因如SEQIDNO.4所示。该载体的制备包括：将thiS基因和thiF基因分别克隆到表达载体pET28-a中，即得。所述用于表达ThiS蛋白和ThiF蛋白的菌种中包含具有thiS基因和/或thiF基因的载体。该菌种的制备包括：将thiS基因和thiF基因分别克隆到表达载体pET28-a中，转化到大肠杆菌中，即得。上述的试剂盒在研究体外类泛素化系统中的应用。具体的，将底物蛋白、ThiS蛋白和ThiF蛋白加入到使用浓度的含有DTT的反应缓冲液中，然后加入ATP，于28-32℃反应4-6h。研究反应前后底物蛋白的性质差异，判断底物蛋白是否能在ThiF蛋白的作用下发生ThiS类泛素化连接。优选的，在30℃反应5h，随后进行检测。在反应前，先将DTT加入至反应缓冲液中混合均匀。由于试剂盒中的各组分均为使用浓度的母液，因此需要计算需加入的H2O的体积，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于研究细菌中类泛素系统的试剂盒，其特征在于：包括ThiS蛋白和ThiF蛋白，或者包括用于表达ThiS蛋白和ThiF蛋白的载体或菌种；所述ThiS蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，ThiF蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
【技术特征摘要】
1.一种用于研究细菌中类泛素系统的试剂盒，其特征在于：包括ThiS蛋白和ThiF蛋白，或者包括用于表达ThiS蛋白和ThiF蛋白的载体或菌种；所述ThiS蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，ThiF蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：还包括反应缓冲液、DTT和/或ATP，所述反应缓冲液中包括MgCl2和Tris-HCl。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述反应缓冲液中MgCl2和Tris-HCl的摩尔浓度比为2.3-2.7：45-55。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述ThiS蛋白和ThiF蛋白由基因工程的方法制备得到，具体为：将thiS基因和thiF基因分别克隆到表达载体pET28-a中，转化到大肠杆菌中，诱导表达、纯...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐西兵，沈国民，曹青，沈滟，
申请(专利权)人：河南科技大学，
类型：发明
国别省市：河南,41
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