一种小公鱼免疫调节肽的制备方法技术

一种小公鱼免疫调节肽的制备方法，所述的制备方法包括：选取原料小公鱼进行酶解获得小公鱼蛋白肽，将获得的小公鱼蛋白肽作用于体外培养的巨噬细胞进行筛选酶解条件，通过分离纯化获得小公鱼免疫调节肽产品，通过酶解获得小公鱼蛋白肽是：a）将原料小公鱼清洗后捣碎制成浆料，b）酶解：选用蛋白酶对小公鱼浆料进行酶解，制成酶解液；c）超滤：将酶解液加入超滤系统，用10KD、5KD、3KD的超滤膜进行超滤，收集>10KD、10‑5KD、5‑3KD和

Preparation method of small male fish immunomodulating peptide

The preparation method of the immune regulatory peptide of the small male fish includes: selecting the raw material of the small male fish for enzymatic hydrolysis to obtain the small male fish protein peptide, acting the obtained small male fish protein peptide on the cultured macrophages in vitro to screen the enzymatic hydrolysis conditions, and obtaining the immune regulatory peptide product of the small male fish by isolation and purification, and through enzymatic hydrolysis The hydrolysate was prepared by enzymatic hydrolysis with protease. c) Ultrafiltration: the hydrolysate was added into the ultrafiltration system, and the ultrafiltration membrane was used to collect > 10KD, 10KD, 5KD, 5KD and 3KD.

【技术实现步骤摘要】
一种小公鱼免疫调节肽的制备方法
本专利技术涉及的是一种小公鱼免疫调节肽的制备方法，属于免疫类生物制品

技术介绍
免疫系统是人体进行自我防卫的重要系统。病原体等有害物质进入体内后，免疫系统便自动进行免疫调节，通过识别、阻挡或吞噬抗原，维护人体内环境的稳定。然而非正常的免疫调节也会对人体造成一定的伤害，如免疫缺陷病、自身免疫疾病、超敏反应等。目前，由免疫力低下导致的癌症、肿瘤疾病正处于高发阶段。然而陆地资源不断减少以及海洋探索技术日异月新的发展，使得海洋生物资源的应用与开发越来越受到关注。海洋广阔的地域和复杂的环境因素造就了海洋生物的多样性和特殊性。近年来，我国的研究学者从海洋生物中提取生物活性肽对免疫调节功能进行了大量的研究。小公鱼属于鳀科鱼类，为短生命周期和短食物链的鱼类，生长迅速，具有较高的经济价值，是食用动物蛋白的来源之一。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种通过酶解获得蛋白肽，且酶解反应条件温和、反应时间短、效率高，反应过程易控制，蛋白肽得率高，对免疫调节功能作用明显的小公鱼免疫调节肽的制备方法。本专利技术的目的是通过如下技术方案来完成的，一种小公鱼免疫调节肽的制备方法，所述的制备方法包括：选取原料小公鱼进行酶解获得小公鱼蛋白肽，将获得的小公鱼蛋白肽作用于体外培养的巨噬细胞进行筛选酶解条件，通过分离纯化获得小公鱼免疫调节肽产品。作为优选：所述的选取原料小公鱼进行酶解获得小公鱼蛋白肽是：a）将原料小公鱼清洗后捣碎制成浆料，b）酶解：选用蛋白酶对小公鱼浆料进行酶解，制成酶解液；c）超滤：将酶解液加入超滤系统，用10KD、5KD、3KD的超滤膜进行超滤，收集>10KD、10-5KD、5-3KD和<3KD分子量的酶解液；d）将酶解液用葡聚糖凝胶SephadexG25进行凝胶柱层析和缓冲液洗脱，分别收集各峰后，将其作用于体外培养的巨噬细胞进行筛选酶解条件，获得相应的具有生物活性的峰，再用反相高效液相色谱(RT-HPLC)纯化；e）经过反相高效液相色谱(RT-HPLC)纯化及氨基酸序列检测，获得小公鱼免疫调节肽。作为优选：所述的步骤b）中，蛋白酶为胃蛋白酶或胰蛋白酶或木瓜蛋白酶，最佳酶解温度为42℃、pH值为2、料液比为1:8—12g/mL、时间为6—10h、加酶量为1500—1600u/g；所述的步骤d）中，所述的凝胶柱层析和缓冲液洗脱是：PH8.5Tris-HC1缓冲液，0～0.03mol/NaCl梯度洗脱，收集有活性的各峰，冻干后，凝胶柱脱盐；所述的巨噬细胞来源于动物的外周血、骨髓、组织，或经体外诱导分化获得；所述的步骤e）中，所述反相高效液相色谱，即用RT-HPLC进行纯化，其色谱条件是:1)样品前处理:将样品用0.06%TFA的水溶解到0.6ml，离心12000-14000RPM，离心10分钟后取上清；2)系统:Agilent1260HPLC；3)柱子:ZorbaxSB-C184.6X2505um；4)进样体积:80-100ul；5)缓冲液、平衡缓冲液:0.06%TFA洗脱缓冲液:0.05%TFA的乙腈；6)梯度:0%–0%B洗脱4分钟，0%–8%B洗脱25分钟，8%-100%B洗脱1分钟，100%-100%B洗脱5分钟；7)流速:1.0ml/min；8）检测:280nm/214nm。4、根据权利要求3所述的小公鱼免疫调节肽的制备方法，其特征在于：所述的步骤d）中，所述的体外诱导分化是：将单个核细胞用添加有浓度为10—100μg/mL细胞因子的RPMI1604或TCM199完全培养液在36—38℃下培养1—10天，得到巨噬细胞；所述细胞因子为GM—CSF、M—CSF、IL—4和IL—6中的一种或几种。本专利技术通过酶解获得蛋白肽，具有酶解反应条件温和、反应时间短、效率高，反应过程易控制，蛋白肽得率高，对免疫调节功能作用明显等特点。具体实施方式下面将结合具体实施例对本专利技术作详细的介绍：本专利技术所述的一种小公鱼免疫调节肽的制备方法，所述的制备方法包括：选取原料小公鱼进行酶解获得小公鱼蛋白肽，将获得的小公鱼蛋白肽作用于体外培养的巨噬细胞进行筛选酶解条件，通过分离纯化获得小公鱼免疫调节肽产品。作为一种优选的实施例，本专利技术所述的选取原料小公鱼进行酶解获得小公鱼蛋白肽是：a）将原料小公鱼清洗后捣碎制成浆料，b）酶解：选用蛋白酶对小公鱼浆料进行酶解，制成酶解液；c）超滤：将酶解液加入超滤系统，用10KD、5KD、3KD的超滤膜进行超滤，收集>10KD、10-5KD、5-3KD和<3KD分子量的酶解液；d）将酶解液用葡聚糖凝胶SephadexG25进行凝胶柱层析和缓冲液洗脱，分别收集各峰后，将其作用于体外培养的巨噬细胞进行筛选酶解条件，获得相应的具有生物活性的峰，再用反相高效液相色谱(RT-HPLC)纯化；e）经过反相高效液相色谱(RT-HPLC)纯化及氨基酸序列检测，获得小公鱼免疫调节肽。作为进一步的优选实施例：本专利技术在上述公开的基础上，还进一步包括：所述的步骤b）中，蛋白酶为胃蛋白酶或胰蛋白酶或木瓜蛋白酶，最佳酶解温度为42℃、pH值为2、料液比为1:8—12g/mL、时间为6—10h、加酶量为1500—1600u/g；所述的步骤d）中，所述的凝胶柱层析和缓冲液洗脱是：PH8.5Tris-HC1缓冲液，0～0.03mol/NaCl梯度洗脱，收集有活性的各峰，冻干后，凝胶柱脱盐；所述的巨噬细胞来源于动物的外周血、骨髓、组织，或经体外诱导分化获得；所述的步骤e）中，所述反相高效液相色谱，即用RT-HPLC进行纯化，其色谱条件是:1)样品前处理:将样品用0.06%TFA的水溶解到0.6ml，离心12000-14000RPM，离心10分钟后取上清；2)系统:Agilent1260HPLC；3)柱子:ZorbaxSB-C184.6X2505um；4)进样体积:80-100ul；5)缓冲液、平衡缓冲液:0.06%TFA洗脱缓冲液:0.05%TFA的乙腈；6)梯度:0%–0%B洗脱4分钟，0%–8%B洗脱25分钟，8%-100%B洗脱1分钟，100%-100%B洗脱5分钟；7)流速:1.0ml/min；8）检测:280nm/214nm。本专利技术所述的步骤d）中，所述的体外诱导分化是：将单个核细胞用添加有浓度为10—100μg/mL细胞因子的RPMI1604或TCM199完全培养液在36—38℃下培养1—10天，得到巨噬细胞；所述细胞因子为GM—CSF、M—CSF、IL—4和IL—6中的一种或几种。本专利技术通过蛋白酶对小公鱼进行酶解获得蛋白肽，作用于体外培养的巨噬细胞进行筛选酶解条件，通过分离纯化获得小公鱼蛋白肽序列，以期为开发小公鱼蛋白肽功能食品提供实验依据。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种小公鱼免疫调节肽的制备方法，其特征在于所述的制备方法包括：选取原料小公鱼进行酶解获得小公鱼蛋白肽，将获得的小公鱼蛋白肽作用于体外培养的巨噬细胞进行筛选酶解条件，通过分离纯化获得小公鱼免疫调节肽产品。

【技术特征摘要】
1.一种小公鱼免疫调节肽的制备方法，其特征在于所述的制备方法包括：选取原料小公鱼进行酶解获得小公鱼蛋白肽，将获得的小公鱼蛋白肽作用于体外培养的巨噬细胞进行筛选酶解条件，通过分离纯化获得小公鱼免疫调节肽产品。2.根据权利要求1所述的小公鱼免疫调节肽的制备方法，其特征在于所述的选取原料小公鱼进行酶解获得小公鱼蛋白肽是：a）将原料小公鱼清洗后捣碎制成浆料，b）酶解：选用蛋白酶对小公鱼浆料进行酶解，制成酶解液；c）超滤：将酶解液加入超滤系统，用10KD、5KD、3KD的超滤膜进行超滤，收集>10KD、10-5KD、5-3KD和<3KD分子量的酶解液；d）将酶解液用葡聚糖凝胶SephadexG25进行凝胶柱层析和缓冲液洗脱，分别收集各峰后，将其作用于体外培养的巨噬细胞进行筛选酶解条件，获得相应的具有生物活性的峰，再用反相高效液相色谱(RT-HPLC)纯化；e）经过反相高效液相色谱(RT-HPLC)纯化及氨基酸序列检测，获得小公鱼免疫调节肽。3.根据权利要求2所述的小公鱼免疫调节肽的制备方法，其特征在于：所述的步骤b）中，蛋白酶为胃蛋白酶或胰蛋白酶或木瓜蛋白酶，最佳酶解温度为42℃、pH值为2、料液比为1:8—12g/mL、时间为6—10h、加酶量为1500—1600u/g；所述的步骤d）中...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨最素，
申请(专利权)人：浙江海洋大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33