一种固定化环糊精葡萄糖基转移酶的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种固定化环糊精葡萄糖基转移酶的制备方法，属于酶技术领域。本发明专利技术提供了一种利用明胶固定化环糊精葡萄糖基转移酶的制备方法，所述方法包括如下步骤：(1)配制明胶溶液；(2)往明胶溶液中加入环糊精葡萄糖基转移酶进行混合均匀；(3)将混合好的溶液立即倒入平板中成一定厚度；(4)放置4℃进行冷却吸附成凝胶薄膜；(5)将凝胶薄膜切成小碎片，用戊二醛溶液在一定温度下浸泡交联；(6)用水洗净。采用该方法制备的固定化环糊精葡萄糖基转移酶热稳定性和pH稳定性较好，可重复利用性高，同时底物的利用率得到提高，在生产环糊精方面有着巨大的潜力和应用前景。

Preparation of immobilized cyclodextrin glucosyl transferase

The invention relates to a preparation method of immobilized cyclodextrin glucosyltransferase, which belongs to the technical field of enzyme. The invention provides a preparation method for immobilizing cyclodextrin glucosyltransferase with gelatin. The method comprises the following steps: (1) preparing gelatin solution; (2) adding cyclodextrin glucosyltransferase into gelatin solution to mix evenly; (3) immediately pouring the mixed solution into a plate to form a certain thickness; (4) putting it into the gelatin solution; The gel film was formed by cooling and adsorbing at 4 C. (5) The gel film was cut into small pieces and crosslinked with glutaraldehyde solution at a certain temperature; (6) Washed with water. The immobilized cyclodextrin glucosyltransferase prepared by this method has good thermal stability and pH stability, high reusability, and the utilization of substrate has been improved. It has great potential and application prospects in the production of cyclodextrin.

【技术实现步骤摘要】
一种固定化环糊精葡萄糖基转移酶的制备方法
本专利技术涉及一种固定化环糊精葡萄糖基转移酶的制备方法，属于酶

技术介绍
环糊精是由6个及6个以上的D-吡喃葡萄糖单元通过α-1,4-糖苷键连接而成的环状聚合物，呈独特的中空圆筒状结构，具有外亲内疏的特性，因此能包合许多疏水性分子，从而改变它们的理化性质，如溶解性、气味、稳定性等，在食品、生物、医药等领域具有潜在的应用。环糊精葡萄糖基转移酶作为生产环糊精的必需酶，工业上常用其通过环化反应转化淀粉底物制备环糊精。然而，游离的环糊精葡萄糖基转移酶存在热稳定性差、易变性、难分离、无法多次利用等缺点，提高了其生产成本，大大限制了其在实际生产中的应用。目前，固定化酶技术可在一定的程度上解决上述问题。固定化酶能够使得酶可重复使用，酶使用效率提高、使用成本降低；固定化酶极易与反应体系分离，简化了提纯工艺，而且产品收率高、质量好；在多数情况下，酶经固定化后稳定性得到提高。但是，固定化酶也存在一些缺陷。固定化可能造成酶的部分失活，酶活力有损失；酶催化微环境的改变可能导致其反应动力学发生变化；固定化酶的使用成本增加，使工厂的初始投资增大等。目前，固定化环糊精葡萄糖基转移酶的方法有很多：海藻酸钠固定化(郭燕等，2007；Arya等，2006)、壳聚糖固定化(田晖等，1995；JéssiedaNatividade等，2013)、乙醛-琼脂糖固定化(PauloW.Tardioli等，2006)等制备工艺简单，但存在操作过程中黏度高制备难度大、对设备要求高和底物利用率低等缺陷；而氨基丙基三甲氧基硅烷化固定在SiO2微球(CarlaRobertaMatte等，2012)、功能化磁性双中孔核-壳SiO2纳米球(AbdelnasserS.S.Ibrahim等，2014)等存在载体预处理操作繁琐增加工业成本、重复利用性差等问题。因此，有必要寻找一种固定化酶环糊精葡萄糖基转移酶的制备方法，既有制备工艺简单、价格低廉、底物利用率高的优点，而且还具有重复利用性高、机械强度高、热稳定性和pH稳定性好的优势，有利于实现连续工业化生产。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种固定化环糊精葡萄糖基转移酶的制备方法，此方法制得的固定化环糊精葡萄糖基转移酶既有制备工艺简单、价格低廉、底物利用率高的优点，而且还具有重复利用性高、机械强度高、热稳定性和pH稳定性较好的优势，有利于实现连续工业化生产。本专利技术的技术方案如下：本专利技术提供了一种固定化环糊精葡萄糖基转移酶的制备方法，包含如下步骤：步骤1：配制明胶溶液；步骤2：在步骤1得到的明胶溶液中加入环糊精葡萄糖基转移酶，并混合均匀；步骤3：将步骤2得到的混合溶液倒入平板中，成一定厚度；步骤4：将步骤3中得到的倒入平板中的溶液进行冷却吸附，得到凝胶薄膜；步骤5：将步骤4得到的凝胶薄膜切成小碎片，用戊二醛溶液浸泡交联；步骤6：将步骤5的得到的交联后的凝胶碎片洗净，得到固定化环糊精葡萄糖基转移酶。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤1中明胶溶液的溶质质量百分比浓度为5％-25％。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤2中，往明胶溶液中加入环糊精葡萄糖基转移酶进行混合均匀时，要求明胶溶液预先恒温至45℃，环糊精葡萄糖基转移酶加入量为溶质质量的5％-30％。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤3中，要将步骤2得到的混合溶液立即倒入平板中，防止分层。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤3中倾倒的平板厚度为2-8mm。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤4中的冷却为在4℃下进行放置冷却。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤4中冷却吸附时间至少为30min。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤4中戊二醛溶液浓度为0.1％-1％。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤4中交联温度为0-30℃，交联时间为0.5-3h。本专利技术提供了上述固定化环糊精葡萄糖基转移酶的制备方法制备得到的固定化环糊精葡萄糖基转移酶。本专利技术提供了上述固定化环糊精葡萄糖基转移酶的制备方法在生产环糊精及其衍生物方面的应用。有益效果：(1)本专利技术采用的明胶是一种无抗原性、生物相容性好、可生物降解的天然高分子材料，具有来源丰富、安全环保的优点。(2)本专利技术利用明胶包埋交联固定化环糊精葡萄糖基转移酶，优点在于：制备工艺简单，价格低廉，制备条件温和，酶回收率较高，且利于产品的分离纯化。与海藻酸钠包埋交联法相比，具有凝胶网孔可控从而能与底物反应、酶回收率较高等优点；与壳聚糖包埋交联法相比，具有机械强度高、稳定性好等优点；与单独戊二醛交联法相比，具有反应条件温和、酶催化活性不易受影响等优点；与树脂吸附法相比，具有工艺简单、结合能力强、酶回收率高等优点。(3)利用明胶包埋交联固定化环糊精葡萄糖基转移酶，具有连续操作稳定性好、热稳定性和pH稳定性均提高、底物利用率高等优点，具有潜在的实际应用价值。附图说明图1游离和固定化环糊精葡萄糖基转移酶在55℃下的热稳定性。图2-4游离环糊精葡萄糖基转移酶在55℃下的pH稳定性。图5-7固定化环糊精葡萄糖基转移酶在55℃下的pH稳定性。图8固定化环糊精葡萄糖基转移酶的重复利用性评价。图9明胶浓度对固定化环糊精葡萄糖基转移酶环化活力的影响。图10交联时间对固定化环糊精葡萄糖基转移酶环化活力的影响。图11温度对游离和固定化环糊精葡萄糖基转移酶环化活力的影响。图12pH对游离环糊精葡萄糖基转移酶环化活力的影响。图13pH对固定化环糊精葡萄糖基转移酶环化活力的影响。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术的
技术实现思路
做进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本专利技术的保护范围。固定化酶环化活力的测定方法如下：取制备好的固定化酶2g，加入装有20mL预先用10mM磷酸缓冲液(pH6.5)配制的5％(w/v)麦芽糊精(DE＝4)溶液的试管中，在50℃下反应10min后，取出1mL煮沸灭酶15min。结束后加入3.5mL30mMNaOH，再加入0.5mL由5mMNa2CO3溶液配制的0.02％(w/v)酚酞溶液，在室温下显色20min，在550nm下测定吸光度。以未添加酶作为空白。一个酶活单位定义为在上述条件下每分钟生成1μmolβ-环糊精所需的酶量。酶活按公式(1)计算：式中：X—CGT酶活；A—样品与空白差值；k—标准曲线斜率；V—反应体系体积，20mL；M—为产物环糊精相对分子质量，Mα-环糊精＝973g/mol、Mβ-环糊精＝1135g/mol；Tmin—反应时间，10min；m—固定化酶质量，2g；10-3、106—单位换算，1mL＝10-3L、1mol＝106μmol。游离酶环化活力的测定方法同上：将“取制备好的固定化酶2g”改成“量取20μL游离酶液”。酶活力回收率按照以下公式进行计算：酶活回收率(％)＝固定化酶总活力/游离酶总活力×100％酶机械强度的测定方法如下：机械强度通过在一定搅拌速度下反应后的颗粒完整程度进行评价。酶热稳定性的测定方法如下：将游离酶和制备好的明胶固定化酶分别在不同温度(30-80℃)下保温，在不同时间点(15、30、60、90、120min)取样，迅速冰水浴冷却，进行残余环化活力的测定，将未保温酶的环化活力定为100％，计算相对活力，以时间为横坐标本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种固定化环糊精葡萄糖基转移酶的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：步骤1：配制明胶溶液；步骤2：在步骤1得到的明胶溶液中加入环糊精葡萄糖基转移酶，并混合均匀；步骤3：将步骤2得到的混合溶液倒入平板中，成一定厚度；步骤4：将步骤3中得到的倒入平板中的溶液进行冷却吸附，得到凝胶薄膜；步骤5：将步骤4得到的凝胶薄膜切成小碎片，用戊二醛溶液浸泡交联；步骤6：将步骤5的得到的交联后的凝胶碎片洗净，得到固定化环糊精葡萄糖基转移酶。

【技术特征摘要】
1.一种固定化环糊精葡萄糖基转移酶的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：步骤1：配制明胶溶液；步骤2：在步骤1得到的明胶溶液中加入环糊精葡萄糖基转移酶，并混合均匀；步骤3：将步骤2得到的混合溶液倒入平板中，成一定厚度；步骤4：将步骤3中得到的倒入平板中的溶液进行冷却吸附，得到凝胶薄膜；步骤5：将步骤4得到的凝胶薄膜切成小碎片，用戊二醛溶液浸泡交联；步骤6：将步骤5的得到的交联后的凝胶碎片洗净，得到固定化环糊精葡萄糖基转移酶。2.如权利要求1所述的一种固定化环糊精葡萄糖基转移酶的制备方法，其特征在于，所述步骤1中明胶溶液的溶质质量百分比浓度为5％-25％。3.如权利要求1或2所述的一种固定化环糊精葡萄糖基转移酶的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，往明胶溶液中加入环糊精葡萄糖基转移酶进行混合均匀时，要求明胶溶液预先恒温至45℃，环糊精葡萄糖基转移酶加入量为溶质质量的5％-30％。4.如权利要求1-3任一所述的一种固定化环糊精葡萄糖基转...

【专利技术属性】
技术研发人员：李兆丰，李才明，陈双娣，顾正彪，李泽西，程力，洪雁，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32