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减毒类脂A的制备与应用制造技术

技术编号:18675912 阅读:44 留言:0更新日期:2018-08-14 21:44
本发明专利技术公开了减毒类脂A的制备与应用,属于基因工程技术领域。本发明专利技术在非致病菌大肠杆菌中表达lpxD1基因片段或lpxD2基因片段对类脂A进行分子改造,得到了脂肪酸链结构发生改变的类脂A,而表达lpxD1基因片段或lpxD2基因片段的重组大肠杆菌对细胞的毒性降低。本发明专利技术为制备疫苗佐剂提供了新的方法和思路。

Preparation and application of attenuated lipid A

The invention discloses the preparation and application of attenuated lipid A, and belongs to the field of gene engineering technology. The lipoid A is modified by expressing the lpxD1 gene fragment or the lpxD2 gene fragment in non-pathogenic E. coli, and the lipoid A whose fatty acid chain structure has been changed is obtained. The recombinant E. coli expressing the lpxD1 gene fragment or the lpxD2 gene fragment has lower cytotoxicity to cells. The invention provides a new method and train of thought for preparing vaccine adjuvants.

【技术实现步骤摘要】
减毒类脂A的制备与应用
本专利技术涉及减毒类脂A的制备与应用,属于基因工程

技术介绍
脂多糖(LPS),俗称内毒素,位于革兰氏阴性菌的外膜外侧,并且是该部位的主要组成成分。由类脂A,核心多糖和O抗原三部分组成,,类脂A是脂多糖的活性中心,是引起免疫反应的主要结构。LPS可以激发宿主的非特异性免疫。LPSbindingprotein(LBP)将LPS运送到细胞表面,在CD14和MD-2的帮助下,被细胞表面的受体Tolllikereceptor4(TLR4)识别,随后发生了一系列信号传递,最终导致一系列炎症因子的释放。这其中主要有Mal-MyD88和TRAM-TRIF两条信号通路组成,能分别产生不同生物细胞因子,Mal-MyD88主要诱导产生TNF-α,IL-6和IL-8,TRAM主要产生RANTES和MCP-1等。疫苗佐剂就是免疫增强剂,可以在疫苗接种作用过程中起到辅助作用,有助于更好更全面的激发非特异性免疫,使疫苗更好的发挥作用。LPS可以引发一系列的炎症因子的释放,而类脂A又是LPS的活性中心,所以将类脂A作为疫苗佐剂成为新型疫苗佐剂的重要研究方向。目前被广泛应用的类脂A疫苗佐剂是来自沙门氏菌的单磷酸、六条脂肪酸链类脂A(MPL),这种由自沙门氏菌突变株产生的MPL,结构与野生型E.coli的类脂A结构有所不同,C1磷酸基团和C3位十四烷基缺失,在C2位脂肪酸链多出十六烷次级脂肪酸链。MPL对通路TLR4-Mal-MyD88的刺激程度低,对TLR4-TRAM-TRIF有有效的刺激,从而MPL可以有效的刺激非特异性免疫,又不会产生过量的炎症因子伤害机体。但是MPL在工业生产和临床应用也有不足之处,如MPL的生产沙门氏菌属于条件致病菌,在进行工业大规模生产有一定风险和应用到兽类疫苗,其次MPL的生产工艺复杂,在生产纯化中对其结构造成破坏等问题。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一类新型的类脂A,其结构如下式Ⅰ所示:本专利技术第二个目的是提供所述类脂A的制备方法,包括以下步骤:(1)构建表达lpxD1基因片段或lpxD2基因片段的重组大肠杆菌;(2)培养重组大肠杆菌,提取收集类脂A。具体地,利用Bligh-Dyer一相体系(氯仿/甲醇/水溶液,1:2:0.8,v/v/v)悬浮菌体,离心收集下相;下相加入醋酸钠(pH4.5)溶液,沸水浴裂解糖链;然后加入氯仿和甲醇形成Bligh-Dyer二相体系(氯仿/甲醇/水,2:2:1.8,v/v/v),离心,取下相旋蒸,加入氯仿/甲醇溶液(4:1,v/v)洗出类脂A。在本专利技术的一种实施方式中,步骤(1)所述大肠杆菌是E.coliRL25、W3110或HW002。在本专利技术的一种实施方式中,步骤(1),将来自于弗朗西斯菌的lpxD1基因片段或lpxD2基因片段酶切连接质粒pUC18,然后转入宿主细胞。在本专利技术的一种实施方式中,所述的lpxD1基因片段的核苷酸序列是SEQIDNO:1的序列,lpxD2基因片段的核苷酸序列是SEQIDNO:2的序列。在本专利技术的一种实施方式中,步骤(2)收集培养到对数后期的重组大肠杆菌菌体,ddH2O洗涤菌体后用Bligh-Dyer一相体系(氯仿/甲醇/水溶液,1:2:0.8,v/v/v)悬浮菌体,磁力搅拌一段时间、分相,使用Bligh-Dyer一相体系洗涤细胞碎片2-3次;加入醋酸钠(pH4.5)溶液,超声震荡,沸水浴裂解糖链;冷至室温后加入氯仿和甲醇形成Bligh-Dyer二相体系(氯仿/甲醇/水,2:2:1.8,v/v/v),离心,取下相移入旋蒸瓶中,旋转蒸发,加入氯仿/甲醇溶液(4:1,v/v)将类脂A洗出。本专利技术的第三个目的是提供一种降低大肠杆菌菌体对TLR4通路刺激强度或细胞免疫活性的方法,是在大肠杆菌中通过pUC质粒表达了lpxD1基因片段,所述大肠杆菌是W3110或HW002。本专利技术的第四个目的是提供所述重组大肠杆菌及类脂A在疫苗佐剂方面的应用。本专利技术的有益效果:(1)本专利技术采用了非致病菌E.coliRL25、W3110和HW002为宿主制备类脂A,拓宽了佐剂临床应用范围。在宿主中分别表达了lpxD1基因片段或lpxD2基因片段对类脂A进行分子改造,然后采用氯仿/甲醇/H2O溶液混合相萃取法,可以有效快速的提取类脂A,相对减少了生产流程和对类脂A结构的破坏。(2)通过GC-MS和碱水解质谱分析的方法对本专利技术制备得到的类脂A进行分析,相比未表达lpxD1基因片段或lpxD2基因片段,表达lpxD1基因片段或lpxD2基因片段后菌体类脂A的结构发生改变,E.coliRL25/pUC-lpxD1的结构改变表现在2和2’位置上的脂肪酸链由单一的C14:3-OH脂肪酸链变成了C14:3-OH、C16:3-OH和C18:3-OH混合存在。E.coliRL25/pUC-lpxD2的结构改变表现在2和2’位置上的脂肪酸链由单一的C14:3-OH脂肪酸链变成了C14:3-OH和C16:3-OH混合存在。这两种菌株在42℃的培养条件下,对TLR4的信号通路刺激能力降低,对细胞的毒性降低。(3)在大肠杆菌W3110和HW002中通过pUC质粒分别表达了lpxD1基因片段,能够降低W3110和HW002菌体对TLR4通路刺激强度或细胞免疫活性。总的来说,本专利技术提供的新型类脂A作为疫苗佐剂,具有更安全性、易于提取制备的优点。附图说明图1.菌体E.coliRL25、E.coliRL25/pUC-lpxD1和E.coliRL25/pUC-lpxD2类脂A结构质谱分析。图2.菌体E.coliRL25、E.coliRL25/pUC-lpxD1和E.coliRL25/pUC-lpxD2类脂A碱水解后结构质谱分析,A为25%氢氧化铵水解结果,B为0.3M的氢氧化钠的水解图。图3.菌体E.coliRL25、E.coliRL25/pUC-lpxD1和E.coliRL25/pUC-lpxD2类脂A中脂肪酸链的GC-MS分析。图4.菌体E.coliRL25、E.coliRL25/pUC-lpxD1和E.coliRL25/pUC-lpxD2自凝集能力的比较。图5.菌体E.coliRL25、E.coliRL25/pUC-lpxD1和E.coliRL25/pUC-lpxD2对TLR4通路刺激程度的分析。图6.RL25/pUC,RL25/pUC-lpxD1和RL25/pUC-lpxD2对细胞免疫活性的比较。A为不同菌体不同浓度LPS刺激小鼠RAW267.4细胞产生的细胞因子的情况,B为不同菌体不同浓度LPS刺激人THP-1细胞产生的细胞因子的情况。图7.LpxD1表达菌株的类脂A结构鉴定。A为W3110/pUC和W3110/pUC-lpxD1的类脂A的ESI/MS分析,B为HW002/pUC和HW002/pUC-lpxD1的类脂A的ESI/MS分析。图8.LpxD1表达菌株与对照菌株对细胞TLR4通路刺激程度的比较。图9.LpxD1表达菌株的LPS对细胞免疫活性的比较。具体实施方式实施例1基因工程菌的构建查找出lpxD1和lpxD2基因序列。根据lpxD1、lpxD2和pUC质粒的核苷酸序列选取酶切位点。设计引物,进行PCR,回收lpxD1和lpxD2基因表达片段本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.类脂A,其特征在于,其结构如下式Ⅰ或式Ⅱ所示:

【技术特征摘要】
1.类脂A,其特征在于,其结构如下式Ⅰ或式Ⅱ所示:2.一种制备权利要求1所述类脂A的方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)构建表达lpxD1基因片段或lpxD2基因片段的重组大肠杆菌;(2)培养重组大肠杆菌,提取收集类脂A。3.根据权利要求2所述的一种制备权利要求1所述类脂A的方法,其特征在于,步骤(1)所述大肠杆菌是E.coliRL25、W3110或HW002。4.根据权利要求2或3所述的一种制备权利要求1所述类脂A的方法,其特征在于,步骤(1),将来自于弗朗西斯菌的lpxD1基因片段或lpxD2基因片段酶切连接质粒pUC18,然后转入宿主细胞。5.根据权利要求2所述的一种制备权利要求1所述类脂A的方法,其特征在于,所述的lpxD1基因片段的核苷酸序列是SEQIDNO:1的序列,lpxD2基因片段的核苷酸序列是SEQIDNO:2的序列。6.根据权利要求2所述的一种制备权利要求1所述类脂A的方法,其特征在于,步骤(2)收集培养到对数后期的重组大肠杆菌菌体,d...

【专利技术属性】
技术研发人员:李颜颜王小元李烨云建贾向印
申请(专利权)人:江南大学
类型:发明
国别省市:江苏,32

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