一种筛查正清风痛宁制剂中潜在致敏组分的方法技术

本发明专利技术公开了一种筛查正清风痛宁制剂中潜在致敏组分的方法，该方法包括构建细胞膜色谱‑‑CMC2、构建CMC‑HPLC/MS系统的具体步骤；正清风痛宁制剂原料或注射剂样品进入CMC系统，致敏组分，会与肥大细胞膜结合，被CMC系统识别并将出峰，其根据其在细胞膜上保留的时间对其保留组分进行接液，接液浓缩；将所得的浓缩液作为新的样品，进入HPLC/MS系统进行化学结构检测，对HPLC/MS分析中的ESI‑MS图谱进行分析，根据其分子离子峰可以判断出浓缩液中的化学成分，即为致敏组分。本发明专利技术建立了高效、灵敏的正清风痛宁制剂药物类过敏组分的筛查方法，提高了致敏组分筛选准确率。

A method to screen potential allergenic components in Zheng Qing Feng Tong Ning preparation

The invention discloses a method for screening potential sensitizing components in Zhengqing Fengtongning preparation, which comprises the steps of constructing cell membrane chromatography CMC2 and constructing CMC HPLC/MS system; the raw materials or injection samples of Zhengqing Fengtongning preparation enter CMC system, and the sensitizing components are combined with mast cell membrane and recognized by CMC system. According to their retention time on the cell membrane, the retention components were connected and concentrated. The concentrate was used as a new sample, and the chemical structure of the concentrate was detected by HPLC / MS system. The ESI MS spectrum in the analysis of HPLC / MS was analyzed. According to the molecular ion peak, the concentrate could be judged. The chemical composition is the sensitizing component. The invention establishes a highly effective and sensitive screening method for drug allergic components of Zhengqing Fengtongning preparation, and improves the screening accuracy of allergic components.

【技术实现步骤摘要】
一种筛查正清风痛宁制剂中潜在致敏组分的方法
本专利技术涉及一种药物中致敏组分筛查方法，特别涉及一种筛查正清风痛宁制剂中潜在致敏组分的方法。
技术介绍
在口服或注射某些药物后，一些人会发生一系列与过敏相似的类过敏反应，如皮疹、瘙痒、血压和心率变化等，称之为类过敏反应，此反应为非抗原物质首次与机体接触发生的过敏样反应。这是由于药物激活了肥大细胞，直接导致组胺释放，造成类过敏反应。在这一过程中，肥大细胞上的蛋白质“MRGPRX2”作为受体，起到了关键性作用。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种筛查正清风痛宁制剂中潜在致敏组分的方法，本专利技术目的是通过如下方法实现的：一种筛查正清风痛宁制剂中潜在致敏组分的方法，该方法包括如下步骤：1、构建细胞膜色谱(CMC)1.1)选择MrgXs受体类型细胞LAD2，RPMC，MPMC，MrgX2-HEK293，MrgX3-HEK293五种，将MRGPRX2受体高表达的细胞悬液于2-6℃，离心，得沉淀为细胞；加入生理盐水清洗，重复1-3次；细胞用2-6℃冰浴超声，并细胞破碎4-8次；然后悬浮液于2-6℃，离心；吸取上清液；再次于2-6℃，离心，吸弃上清液，得到细胞沉淀；细胞沉淀加入生理盐水，得到细胞膜溶液；1.2)取硅胶，活化；活化硅胶在室温下抽真空冷却至不烫；再于冰上，抽真空冷却；在抽真空状态下，将1.1)制备的细胞膜溶液与活化硅胶混合至均匀；2-6℃条件下磁力震荡，吸出磁子后静置过夜；然后在2-6℃下，离心，弃上清液；生理盐水清洗沉淀，重复1-3次；得到硅胶细胞膜混悬液。细胞膜色谱柱装柱中加入1.2)所制备硅胶细胞膜混悬液，然后用三蒸水补满色谱柱；以超纯水为流动相，将压力稳定到6～12Mpa后，色谱柱下端有液体滴落时开始计时，计时2-10min，即装填好细胞膜固定相。2、构建CMC-HPLC/MS系统将装填好细胞膜固定相的柱芯装入不锈钢柱套中，装入液相色谱仪中，以纯水为流动相，构成CMC系统；样品进入CMC系统等度洗脱，样品中存在的致敏组分，会与肥大细胞膜结合，被CMC系统识别并将出峰，其余组分则被洗脱。致敏组分若在细胞膜上有保留，根据其在细胞膜上保留的时间对其保留组分进行接液，接液8-15次后将所得的溶液浓缩；将所得的浓缩液作为新的样品，进入HPLC/MS系统进行化学结构检测，对HPLC/MS分析中的ESI-MS图谱(常规的分子离子保留图谱，也称电喷雾电离质谱)进行分析，根据其分子离子峰判断出浓缩液中的化学成分，即为致敏组分。本专利技术筛查正清风痛宁制剂中潜在致敏组分的方法，可以优选为：1、构建细胞膜色谱(CMC)：1.1)选择MrgXs受体类型细胞LAD2，RPMC，MPMC，MrgX2-HEK293，MrgX3-HEK293五种，将MRGPRX2受体高表达的细胞悬液于4℃，1200rmp离心5min，得沉淀为细胞；加入生理盐水清洗，重复2次；细胞用4℃冰浴超声30min，并用细胞破碎仪破碎5～6次；然后悬浮液于4℃，1200rmp离心10min；吸取上清液；再次于4℃，12000rmp离心30min，吸弃上清液，得到细胞沉淀；细胞沉淀加入5ml生理盐水，得到细胞膜溶液；1.2)取硅胶0.05g，105℃活化30min；活化硅胶在室温下抽真空冷却至不烫；再于冰上，抽真空冷却；在抽真空状态下，将1.1)制备的细胞膜溶液5ml与活化硅胶混合至均匀；4℃条件下磁力震荡30min，吸出磁子后静置过夜；然后在4℃下，3000rmp离心5min，弃上清液；生理盐水清洗沉淀，重复2次；得到硅胶细胞膜混悬液。细胞膜色谱柱装柱中加入1.2)所制备硅胶细胞膜混悬液，然后用三蒸水补满色谱柱；以超纯水为流动相，流速为2.0mL/min，将压力稳定到8～10Mpa后，色谱柱下端有液体滴落时开始计时，计时5min，即装填好细胞膜固定相。2、构建CMC-HPLC/MS系统；将装填好细胞膜固定相的柱芯装入不锈钢柱套中，装入液相色谱仪中，以纯水为流动相，构成CMC系统；样品以0.1～0.2ml/min流速进入CMC系统等度洗脱，样品中存在的致敏组分，会与肥大细胞膜结合，被CMC系统识别并将在20～50min出峰，其余组分则被洗脱。致敏组分若在细胞膜上有保留，根据其在细胞膜上保留的时间对其保留组分进行接液，接液8-15次后将所得的溶液浓缩；将所得的浓缩液作为新的样品，进入HPLC/MS系统进行化学结构检测，对HPLC/MS分析中的ESI-MS图谱进行分析，根据其分子离子峰可以判断出浓缩液中的化学成分，即为致敏组分。正清风痛宁注射液是由盐酸青藤碱制成的灭菌水溶液，辅料有乙二胺四醋酸二钠(EDTA-2Na)和亚硫酸氢钠(NaHSO3)。本专利技术建立了高效、灵敏的正清风痛宁制剂药物类过敏组分的筛查方法，提高了致敏组分筛选准确率。实施例1构建细胞膜色谱(CMC)1.1)选择MrgXs受体类型细胞LAD2，RPMC，MPMC，MrgX2-HEK293，MrgX3-HEK293五种，将MRGPRX2受体高表达的细胞悬液于4℃，1200rmp离心5min，得沉淀为细胞；加入生理盐水清洗，重复2次；细胞用4℃冰浴超声30min，并用细胞破碎仪破碎5～6次；然后悬浮液于4℃，1200rmp离心10min；吸取上清液；再次于4℃，12000rmp离心30min，吸弃上清液，得到细胞沉淀；细胞沉淀加入5ml生理盐水，得到细胞膜溶液；1.2)取硅胶0.05g，105℃活化30min；活化硅胶在室温下抽真空冷却至不烫；再于冰上，抽真空冷却；在抽真空状态下，将1.1)制备的细胞膜溶液5ml与活化硅胶混合至均匀；4℃条件下磁力震荡30min，吸出磁子后静置过夜；然后在4℃下，3000rmp离心5min，弃上清液；生理盐水清洗沉淀，重复2次；得到硅胶细胞膜混悬液。细胞膜色谱柱装柱中加入1.2)所制备硅胶细胞膜混悬液，然后用三蒸水补满色谱柱；以超纯水为流动相，流速为2.0mL/min，将压力稳定到8～10Mpa后，色谱柱下端有液体滴落时开始计时，计时5min，即装填好细胞膜固定相。构建CMC-HPLC/MS系统将装填好细胞膜固定相的柱芯装入不锈钢柱套中，装入液相色谱仪中，以纯水为流动相，构成CMC系统；样品以0.1～0.2ml/min流速进入CMC系统等度洗脱，样品中存在的致敏组分，会与肥大细胞膜结合，被CMC系统识别并将在20～50min出峰，其余组分则被洗脱。致敏组分若在细胞膜上有保留，根据其在细胞膜上保留的时间对其保留组分进行接液，接液8-15次后将所得的溶液浓缩；将所得的浓缩液作为新的样品，进入HPLC/MS系统进行化学结构检测，对HPLC/MS分析中的ESI-MS图谱进行分析，根据其分子离子峰可以判断出浓缩液中的化学成分，即为致敏组分。潜在致敏组分致敏活性的分析验证：(1)β-氨基己糖苷酶释放率测定实验将LAD2细胞悬液稀释为终浓度为5×105个细胞/mL，每孔100μL接种于96孔板(使每孔最终的细胞量为5×104个细胞)。将96孔板置于CO2培养箱中，培养过夜(原代细胞培养2小时)，等待细胞贴壁。次日，对于给药组细胞，每孔吸弃原培养基，加入含有不同浓度的致敏组分或含有终浓度为30μg/mL阳性药物C48/80(Compou本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种筛查正清风痛宁制剂中潜在致敏组分的方法，该方法包括如下步骤：构建细胞膜色谱—CMC：1.1)选择MrgXs受体类型细胞LAD2，RPMC，MPMC，MrgX2‑HEK293，MrgX3‑HEK293五种，将MRGPRX2受体高表达的细胞悬液于2‑6℃，离心，得沉淀为细胞；加入生理盐水清洗，重复1‑3次；细胞用2‑6℃冰浴超声，并细胞破碎4‑8次；然后悬浮液于2‑6℃，离心；吸取上清液；再次于2‑6℃，离心，吸弃上清液，得到细胞沉淀；细胞沉淀加入生理盐水，得到细胞膜溶液；1.2)取硅胶，活化；活化硅胶在室温下抽真空冷却至不烫；再于冰上，抽真空冷却；在抽真空状态下，将1.1)制备的细胞膜溶液与活化硅胶混合至均匀；2‑6℃条件下磁力震荡，吸出磁子后静置过夜；然后在2‑6℃下，离心，弃上清液；生理盐水清洗沉淀，重复1‑3次；得到硅胶细胞膜混悬液；细胞膜色谱柱装柱中加入1.2)所制备硅胶细胞膜混悬液，然后用三蒸水补满色谱柱；以超纯水为流动相，将压力稳定到6～12Mpa后，色谱柱下端有液体滴落时开始计时，计时2‑10min，即装填好细胞膜固定相。构建CMC‑HPLC/MS系统：将装填好细胞膜固定相的柱芯装入不锈钢柱套中，装入液相色谱仪中，以纯水为流动相，构成CMC系统；样品进入CMC系统等度洗脱，样品中存在的致敏组分，会与肥大细胞膜结合，被CMC系统识别并将出峰，其余组分则被洗脱；致敏组分在细胞膜上有保留，根据其在细胞膜上保留的时间对其保留组分进行接液，接液8‑15次后将所得的溶液浓缩；将所得的浓缩液作为新的样品，进入HPLC/MS系统进行化学结构检测，对HPLC/MS分析中的ESI‑MS图谱进行分析，根据其分子离子峰判断出浓缩液中的化学成分，即为致敏组分。...

【技术特征摘要】
1.一种筛查正清风痛宁制剂中潜在致敏组分的方法，该方法包括如下步骤：构建细胞膜色谱—CMC：1.1)选择MrgXs受体类型细胞LAD2，RPMC，MPMC，MrgX2-HEK293，MrgX3-HEK293五种，将MRGPRX2受体高表达的细胞悬液于2-6℃，离心，得沉淀为细胞；加入生理盐水清洗，重复1-3次；细胞用2-6℃冰浴超声，并细胞破碎4-8次；然后悬浮液于2-6℃，离心；吸取上清液；再次于2-6℃，离心，吸弃上清液，得到细胞沉淀；细胞沉淀加入生理盐水，得到细胞膜溶液；1.2)取硅胶，活化；活化硅胶在室温下抽真空冷却至不烫；再于冰上，抽真空冷却；在抽真空状态下，将1.1)制备的细胞膜溶液与活化硅胶混合至均匀；2-6℃条件下磁力震荡，吸出磁子后静置过夜；然后在2-6℃下，离心，弃上清液；生理盐水清洗沉淀，重复1-3次；得到硅胶细胞膜混悬液；细胞膜色谱柱装柱中加入1.2)所制备硅胶细胞膜混悬液，然后用三蒸水补满色谱柱；以超纯水为流动相，将压力稳定到6～12Mpa后，色谱柱下端有液体滴落时开始计时，计时2-10min，即装填好细胞膜固定相。构建CMC-HPLC/MS系统：将装填好细胞膜固定相的柱芯装入不锈钢柱套中，装入液相色谱仪中，以纯水为流动相，构成CMC系统；样品进入CMC系统等度洗脱，样品中存在的致敏组分，会与肥大细胞膜结合，被CMC系统识别并将出峰，其余组分则被洗脱；致敏组分在细胞膜上有保留，根据其在细胞膜上保留的时间对其保留组分进行接液，接液8-15次后将所得的溶液浓缩；将所得的浓缩液作为新的样品，进入HPLC/MS系统进行化学结构检测，对HPLC/MS分析中的ESI-MS图谱进行分析，根据其分子离子峰判断出浓缩液中的化学成分，即为致敏组分。2.如权利要求1所述的筛查正清风痛宁制剂中潜在致敏组分的方法，该方法包括如下步骤：构建细胞膜色谱—CMC：1....

【专利技术属性】
技术研发人员：彭晓珊，谢志忻，滕健，仇萍，吴飞驰，贺浪冲，张涛，贺怀贞，车德路，
申请(专利权)人：湖南正清制药集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南,43