一种捕获外泌体的超顺磁纳米微粒及其制备方法和特异性外泌体发光免疫定量检测试剂盒技术

本发明专利技术提供了一种捕获外泌体的超顺磁纳米微粒及其制备方法和特异性外泌体发光免疫定量检测试剂盒；属于外泌体检测技术领域。本发明专利技术所述的捕获外泌体的超顺磁纳米微粒包括超顺磁纳米微粒基体和与所述超顺磁纳米微粒基体偶联的外泌体共有标记物抗体。本发明专利技术提供的特异性外泌体发光免疫定量检测试剂盒包括捕获外泌体的超顺磁纳米微粒、发光标记的外泌体特异性标记物抗体，封闭液、洗涤液、NaOH水溶液、双氧水和校准品，能够实现简便、快速、定量检测特异性外泌体；可以直接用于血清、血浆、胸腹水、尿液、脑脊液标本中特异外泌体的标记物的检测，灵敏度高、稳定性好且检测时间短，操作简便，非常适用于临床检测。

A Superparamagnetic Nanoparticle Capturing Exosome and Its Preparation Method and Specific Exosome Luminescent Immunoassay Kit

The invention provides a superparamagnetic nanoparticle capturing exosome, a preparation method and a specific exosome luminescence immunoassay kit, belonging to the technical field of exosome detection. The superparamagnetic nanoparticles capturing exosomes of the invention include a superparamagnetic nanoparticle matrix and a common marker antibody to the exosomes coupled with the superparamagnetic nanoparticle matrix. The specific exosome luminescent immunoassay kit provided by the invention comprises superparamagnetic nanoparticles capturing exosomes, luminescent labeled exosome specific marker antibodies, blocking solution, detergent solution, NaOH aqueous solution, hydrogen peroxide and calibration products, which can realize simple, rapid and quantitative detection of specific exosomes. It can be directly used for the detection of specific exosome markers in serum, plasma, pleural and ascites, urine and cerebrospinal fluid samples with high sensitivity, good stability, short detection time, simple operation, and is very suitable for clinical detection.

【技术实现步骤摘要】
一种捕获外泌体的超顺磁纳米微粒及其制备方法和特异性外泌体发光免疫定量检测试剂盒
本专利技术属于外泌体检测
，具体涉及一种捕获外泌体的超顺磁纳米微粒及其制备方法和特异性外泌体发光免疫定量检测试剂盒。
技术介绍
外泌体是细胞释放到胞外的大小为30nm～200nm的双层膜性囊泡，携带大量蛋白质、脂质和RNAs等物质，介导体内细胞间的信息传导，从而影响细胞的生理功能。外泌体膜表面除了共有标记物(如CD9、CD63、CD81等)外，亦表达多种特异性标记物(如GPC1、GPC3、PSMA、TMEM256、EpCAM等)，这些特异性外泌体高度反映了宿主细胞类型和状态。研究显示，分离检测特异性外泌体对疾病诊断、治疗监控与预后判断具有重要意义，尤其在恶性肿瘤诊断方面具有很高诊断特异性和诊断灵敏度。目前对于体液中特异性外泌体的检测主要是先通过超速离心法进行外泌体的分离纯化，然后对外泌体特殊标记物进行检测，这种方式耗时长，不方便，不利于临床常规开展。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种捕获外泌体的超顺磁纳米微粒及其制备方法和特异性外泌体发光免疫定量检测试剂盒。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：一种捕获外泌体的超顺磁纳米微粒，包括超顺磁纳米微粒基体、外泌体共有标记物抗体；所述超顺磁纳米微粒基体包括氧化铁纳米粒子和偶联单元；所述超顺磁纳米微粒基体通过所述的偶联单元与外泌体共有标记物抗体偶联，所述偶联单元为羧基磷脂聚乙二醇。优选的，所述外泌体共有标记物抗体包括anti-CD9、anti-CD63、anti-CD81和anti-Flotillin-1中的一种或几种。优选的，所述超顺磁纳米微粒的粒径为3～50nm。本专利技术还提供了所述捕获外泌体的超顺磁纳米微粒的制备方法，包括以下步骤：1)将偶联单元羧基磷脂聚乙二醇、氧化铁纳米粒子和三氯甲烷在超声条件下中进行氧化反应，获得的羧基修饰氧化铁纳米粒子为超顺磁纳米微粒基体；2)将所述超顺磁纳米微粒基体与外泌体共有标记物抗体缩合偶联，获得捕获外泌体的超顺磁纳米微粒。优选的，步骤2)中所述的偶联采用N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐化学偶联法进行。本专利技术还提供了一种特异性外泌体发光免疫定量检测试剂盒，包括上述的捕获外泌体的超顺磁纳米微粒、发光标记的外泌体特异性标记物抗体，封闭液、洗涤液、NaOH水溶液、双氧水和校准品。优选的，所述发光标记的外泌体特异性标记物抗体为吖啶酯标记的GPC1抗体。优选的，所述封闭液为牛血清白蛋白溶液。优选的，所述洗涤液为含吐温20的PBS溶液。优选的，所述校准品为癌细胞的外泌体。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的超顺磁纳米微粒通过将超顺磁纳米微粒基体与外泌体共有标记物抗体偶联得到，所述超顺磁纳米微粒能够与外泌体的共有标记物特异性结合，从而实现对外泌体的快速、特异和高效捕获。本专利技术提供的特异性外泌体发光免疫定量检测试剂盒，将超顺磁纳米微粒磁性和化学发光免疫的特异性、可检测性结合，能够实现简便、快速、定量检测特异性外泌体；本专利技术提供的特异性外泌体发光免疫定量检测试剂盒可以直接用于血清、血浆、胸腹水、尿液、脑脊液标本中特异外泌体的标记物的检测，灵敏度高、稳定性好且检测时间短，操作简便，非常适用于临床检测。附图说明图1实施例1中GPC1+外泌体蛋白WesternBlot结果图；图2实施例1流式细胞检测方法筛选外泌体捕获抗体结果图；图3-1为超顺磁纳米微粒基体的电镜图，图3-2为超顺磁纳米微粒基体的动态光散射图；图4超顺磁纳米微粒捕获外泌体的分离装置示意图；图5GPC1+外泌体化学发光免疫学检测技术原理示意图；图6GPC1+外泌体的检测校准曲线图；图7GPC1+外泌体在胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌患者中的表达水平差异对比图；图8GPC1+外泌体对胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌诊断ROC曲线图；图9胰腺癌患者术前及术后5天血清GPC1+外泌体水平变化图。具体实施方式本专利技术提供了一种捕获外泌体的超顺磁纳米微粒，包括超顺磁纳米微粒基体、外泌体共有标记物抗体；所述超顺磁纳米微粒基体包括氧化铁纳米粒子和偶联单元；所述超顺磁纳米微粒基体通过所述的偶联单元与外泌体共有标记物抗体偶联。在本专利技术中所述超顺磁纳米微粒的粒径优选的为3～50nm，更优选的为5～20nm。在本专利技术中所述的超顺磁纳米微粒大小均匀，分散性良好。在本专利技术中所述超顺磁纳米微粒基体通过偶联单元偶联外泌体共有标记物抗体，能够特异性结合外泌体。本专利技术中所述超顺磁纳米微粒基体为具有磁性的氧化铁纳米粒子，本专利技术中所述超顺磁纳米微粒基体负载外泌体共有标记物抗体的比例为0.1-3.0μg(Fe)/μg(IgG)。本专利技术中所述的外泌体共有标记物抗体优选的包括anti-CD9、anti-CD63、anti-CD81和anti-Flotillin-1中的一种或几种；所述偶联单元优选的为羧基磷脂聚乙二醇。本专利技术还提供了所述捕获外泌体的超顺磁纳米微粒的制备方法，包括以下步骤：1)将偶联单元、氧化铁纳米粒子和三氯甲烷在超声条件下中进行氧化反应，获得的羧基修饰氧化铁纳米粒子为超顺磁纳米微粒基体；2)将所述超顺磁纳米微粒基体与外泌体共有标记物抗体缩合偶联，获得捕获外泌体的超顺磁纳米微粒。在本专利技术中，用羧基磷脂聚乙二醇与氧化铁纳米粒子发生氧化反应，获得羧基修饰的氧化铁纳米粒子即为超顺磁纳米微粒基体。在本专利技术中，所述氧化铁纳米微粒的粒度优选为2～40nm；所述的氧化铁纳米粒子的制备方法优选包括：将铁、油酸和十八烯在300～340℃下混合搅拌发生氧化反应；将得到的反应产物经丙酮沉淀，得到氧化铁纳米微粒。在本专利技术中，所述原料铁优选的为单质铁粉，本专利技术中所述反应优选的在氩气保护下进行，本专利技术中所述氩气的流速优选的为0.9～1.2m·s-1；本专利技术中所述氩气的作用为置换反应体系中空气，防止Fe被氧化。在本专利技术中，所述搅拌的转速优选的为100r/min。在本专利技术中所述氧化反应的温度更优选为310～330℃；所述氧化反应的时间优选为20～40min，更优选为30min。在本专利技术中所述氧化反应结束后优选的将反应产物自然降温至20～30℃，然后用丙酮沉淀反应产物；在本专利技术中所述丙酮的用量优选的为60ml。本专利技术优选的将所述丙酮沉淀后的产物进行离心，收集固相组分获得氧化铁纳米粒子。在本专利技术中，所述离心的转速优选的为8000～12000rpm，更优选的为10000rpm；所述离心的时间优选的为8～12min，更优选的为10min。在本专利技术中，所述氧化反应的过程优选具体包括以下步骤：将所述氧化铁纳米粒子和羧基磷脂聚乙二醇在三氯甲烷混合进行第一次超声震荡处理，得到第一混合物；浓缩所述第一混合物获得浓缩产物；对所述浓缩产物进行第二超声震荡处理获得超顺磁纳米微粒基体。本专利技术在获得氧化铁纳米粒子后，将所述氧化铁纳米粒子和羧基磷脂聚乙二醇在三氯甲烷混合进行第一次超声震荡处理，得到第一混合物。本专利技术中所述氧化铁纳米粒子的质量、羧基磷脂聚乙二醇质量、三氯甲烷的体积混合比例优选的为(4～6):(8～12):(2～4)(m/m/v)；所述超声的功率优选为40～60w，更优选为50W；所述超声的频率优选为35～45KHz，更优选的为40KHz；本本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种捕获外泌体的超顺磁纳米微粒，其特征在于，包括超顺磁纳米微粒基体、外泌体共有标记物抗体；所述超顺磁纳米微粒基体包括氧化铁纳米粒子和偶联单元；所述超顺磁纳米微粒基体通过所述的偶联单元与外泌体共有标记物抗体偶联；所述偶联单元为羧基磷脂聚乙二醇。

【技术特征摘要】
1.一种捕获外泌体的超顺磁纳米微粒，其特征在于，包括超顺磁纳米微粒基体、外泌体共有标记物抗体；所述超顺磁纳米微粒基体包括氧化铁纳米粒子和偶联单元；所述超顺磁纳米微粒基体通过所述的偶联单元与外泌体共有标记物抗体偶联；所述偶联单元为羧基磷脂聚乙二醇。2.根据权利要求1所述的超顺磁纳米微粒，其特征在于，所述外泌体共有标记物抗体包括anti-CD9、anti-CD63、anti-CD81和anti-Flotillin-1中的一种或几种。3.根据权利要求1所述的超顺磁纳米微粒，其特征在于，所述超顺磁纳米微粒的粒径为3～50nm。4.权利要求1所述捕获外泌体的超顺磁纳米微粒的制备方法，包括以下步骤：1)将偶联单元羧基磷脂聚乙二醇、氧化铁纳米粒子和三氯甲烷在超声条件下中进行氧化反应，获得的羧基修饰氧化铁纳米粒子为超顺磁纳米微粒基体；2)将所述超顺磁纳米微粒基体与外泌体共有标记物抗体缩合偶联，获得捕获外泌体的超顺磁纳米微粒。5.根据权利要求4...

【专利技术属性】
技术研发人员：陶志华，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33