The invention provides an antigen epitope peptide for simulating enrofloxacin, its preparation method and application. Firstly, based on phage display peptide library technology, a simulated epitope of ENR antigen with GKPYITW sequence was selected from phage display heptapeptide library with anti-ENR monoclonal antibody as target. The present invention provides a method for preparing the antigen mimic epitope by phage amplification and gene recombination, respectively. According to the immune binding characteristics of the antigen mimic epitope, the specific detection method is designed based on enzyme-linked immunosorbent assay, colloidal gold immunochromatography and fluorescent microsphere immunochromatography. The antigen mimic epitope has similar immunoreactivity to the natural ENR molecule, and can replace the high-resistant and expensive ENR standard for the immunological detection of ENR. The detection result is accurate and sensitive.
【技术实现步骤摘要】
一种模拟恩诺沙星的抗原表位肽、其制备方法及应用
本专利技术涉及噬菌体展示肽库
,具体涉及一种模拟恩诺沙星的抗原表位肽、其制备方法及应用。
技术介绍
恩诺沙星(Enrofloxacin,ENR),属于氟喹诺酮类的代表性药物,由于使用方便、成本低廉、疗效显著,广泛用于动物养殖领域细菌、病毒感染性动物疾病的治疗和控制。在养殖业中,一些养殖者不遵循动物休药期,通过滥用ENR来获取更大的经济利益,以致使ENR在动物源性食品中成为一个普遍现象。大量研究表明,长期食用含有ENR残留的食品能够造成人的耐药性,引起消化系统、神经系统和泌尿生殖系统等系统的不良反应以及过敏反应。近年来我国畜禽产品由于该类药物残留超标屡遭出口限制时有发生。因此,加强ENR抗生素残留高灵敏快速检测研究显得尤为重要。目前,食品中ENR的检测方法主要有高效液相色谱、气相色谱、高效液相色谱串联质谱、气相色谱串联质谱和免疫分析等方法,免疫分析方法以其简单方便、灵敏度高、成本较低等特性在ENR的检测中得到了广泛的应用。但是,在实施免疫分析检测的过程中,必须使用ENR标准品为基础原材料来制备竞争抗原或者固相包被抗原,ENR不仅导致人和动物易产生耐药性现象,而且价格昂贵,对检测人员的身体健康和生态环境造成极大的危害。近年来研究人员采用抗原模拟表位成功替代小分子抗原进行了免疫学检测,在这种情况下,如果能获取一种与天然ENR具有相似免疫反应特性的替代性无毒物质,则有望在针对ENR的免疫检测方法中避免使用大量的ENR标准品,以期降低检测成本同时提升安全性。
技术实现思路
本专利技术旨在针对现有技术的技术缺陷,提供一 ...
【技术保护点】
1.一种模拟ENR的抗原表位肽,其氨基酸序列为:GKPYITW。
【技术特征摘要】
1.一种模拟ENR的抗原表位肽,其氨基酸序列为:GKPYITW。2.一种编码权利要求1所述抗原表位肽的基因,其核苷酸序列为:GGTAAGCCTTATTTAACTTGG。3.权利要求1所述抗原表位肽的制备方法,其特征在于包括以下步骤:将具有ENR抗原模拟表位的噬菌体加入至20ml接种有ER2738大肠杆菌的培养液中,37℃150rpm振荡培养4.5h;将培养物转入另一离心管中,4℃12000g离心10min,将上清上部80%体积的部分转入另一离心管中,加入1/6体积的PEG/NaCl,4℃静置过夜;4℃12000g离心15min,沉淀重悬于1mlTBS中,4℃14000rpm离心5min;上清转入另一离心管中,加入1/6体积的PEG/NaCl,冰上孵育1h,4℃14000rpm离心10min;弃上清,沉淀重悬于200μlTBS中。4.权利要求1所述抗原表位肽的制备方法,其特征在于包括以下步骤:1)PCR扩增序列为GGTAAGCCTTATTTAACTTGG的DNA片段,分别采用ACC65I和EagI酶对该DNA片段和pMAl-pIII表达载体进行双酶切;将质粒pMal-PIII和该DNA片段以1:10的摩尔比混匀,于16℃水浴连接12h,取10μl连接产物加至100μl感受态细胞TB1中,充分混匀;冰浴30min后,42℃水浴热激90s,立即冰浴5min后补加600μlLB液体培养液,37℃200rpm培养1h,10000rpm离心1min,吸去上清留取约200μl,涂布于LB-A固体培养基中,37℃过夜培养,得到阳性克隆。2)将上述获得的阳性克隆子,从平板上挑一单菌落接种于5mlLB-A、0.2%蔗糖中,37℃220rpm振荡培养过夜,将过夜培养物按1%(v/v)的接种量接种于50ml的LB-A、0.2%蔗糖培养基中,37℃220rpm振荡培养,当培养物细菌浓度达到OD600nm值为0.6时,向培养物中加入IPTG至终浓度为0.2mM,220rpm振荡培养,将PEG溶液于4℃4000g离心20min收集菌体沉淀,弃上清;重悬细胞于400ml含有30mMTris-HCl、20%蔗糖且pH为8.0的溶液中,加入EDTA至1mM,室温下震荡10min,8000g4℃离心20min,弃上清,沉淀重悬于400ml预冷的5mMMgSO4,冰上震荡10min,4℃8000g离心20min,保留上清,向上清液中加入8mlpH为7.4、浓度为1M的Tris-HCl,获得ENR抗原模拟表位...
【专利技术属性】
技术研发人员:邓省亮,李平,贺伟华,赖卫华,
申请(专利权)人:江西省科学院微生物研究所,
类型:发明
国别省市:江西,36
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