一种特异性检测血清中真菌的试剂及其制备方法技术

发明专利技术人提供了一种特异性检测血清中真菌的试剂，所述试剂的组分包括多粘菌素和鲎试剂。上述技术方案通过在鲎试剂内添加多粘菌素，多粘菌素含有带阳电荷的游离氨基，能与革兰氏阴性菌酯多糖(LPS)也就是细菌内毒素(endotoxin)的磷脂中带阴电荷的磷酸根结合，而使细菌内毒素失活，失活的脂多糖无法与鲎试剂中C因子起反应，从而阻断了C反应，避免了真菌检测中的假阳性结果。多粘菌素对鲎试剂中其他成分及检测血清中其他组分不会发生交叉反应。

A reagent for specific detection of fungi in serum and its preparation method

The inventor provides a specific reagent for detecting fungi in serum. The components of the reagent include polymyxin and tachypleus amebocyte lysate reagent. By adding polymyxin into Limulus reagent, polymyxin contains free amino groups with positive charges, which can bind to the negative charged phosphate in the phospholipids of gram-negative bacterial ester polysaccharides (LPS), i.e. bacterial endotoxin, so that bacterial endotoxin is inactivated and the inactivated lipopolysaccharides can not react with Cause C in Limulus reagent. The reaction results in blocking the C reaction and avoiding false positive results in fungal detection. Polymyxin did not cross react with other components in tachypleus amebocyte lysate reagent and other components in serum.

【技术实现步骤摘要】
一种特异性检测血清中真菌的试剂及其制备方法
本专利技术涉及生化领域，特别是一种特异性检测血清中真菌的试剂及其制备方法。
技术介绍
鲎试剂主要成分包括C因子(FactorC，FC)、B因子(FactorB，FB)、G因子、凝固酶原(Proclottingenzyme)、凝固蛋白原(或显色基质)以及二价阳离子、缓冲盐等。其酶的级联反应基本原理已被广泛研究，包括两条凝集反应途径：一条是由1,3-β-D-葡聚糖介导的G因子(FG)途径，活化的G因子将凝固酶原(Proclottingenzyme)转化为凝固酶(clottingenzyme)，凝固酶再水解显色基质(Boc-Leu-Gly-Arg-pNA),使其游离出对硝基苯胺(pNA)，此时再经过偶氮化反应生成玫瑰红色偶氮物质，在545nm处有吸收峰。另一条是内毒素介导的C因子途径：C因子(FC)结合内毒素而被激活，然后激活B因子，活化的B因子将凝固酶原(Proclottingenzyme)转化为凝固酶(clottingenzyme)，产生假阳性反应。鲎试剂C、G反应体系图程见附图1。由于真菌细胞壁的主要成份是(1-3)-β-D-葡聚糖，所以当(1-3)-β-D-葡聚糖与鲎试剂中G因子反应时，就会激活G因子，但是鲎试剂中也同时存在能与血清中细菌内毒素反应的C因子。因此，目前技术中，在用鲎试剂进行血清真菌检测时，必须对鲎试剂进行层析纯化，除去C因子或/和B因子，但该过程较为复杂，收率较低，G因子和其他组分也会造成一定的损失。
技术实现思路
为此，需要提供一种可以特异性检测血清中真菌的试剂，该试剂屏蔽鲎试剂与血清中内毒素结合的C反应，使之可以特异性的进行真菌检测，避免内毒素产生的假阳性。同时，制备过程简单适合生物医药工业大范围推广，推动鲎试剂检测产业的发展。为实现上述目的，专利技术人提供了一种特异性检测血清中真菌的试剂，所述试剂的组分包括多粘菌素和鲎试剂。细菌内毒素结构为脂多糖，它主要的活性中心是其中的类脂A、类脂A主要由β(1-6)氨基葡双糖组成。其中1，4’位与磷酸相结合，7个分子的脂肪酸是由糖的羟基与氨基结合而成，主要为带阴离子电荷基团。我们发现多粘菌素含有带阳电荷的游离氨基，能与革兰氏阴性菌酯多糖(LPS)也就是细菌内毒素(endotoxin)的磷脂中带阴电荷的磷酸根结合，而使细菌内毒素失活。失活的脂多糖就无法与鲎试剂中C因子起反应。进一步地，所述多粘菌素的的添加量为4.0mg/ml鲎试剂。专利技术人将多粘菌素E溶解于鲎试剂后，1:1做中和细菌内毒素实验，试验结果如下表所示：根据临床上人的血清中细菌内毒素限值为0.03Eu/ml；患者血清中内毒素值A在0.03Eu/ml＜A＜0.2Eu/ml之间，用内毒素含量0.2Eu/ml的血清作为检测血清，向检测血清中添加不同浓度的多粘菌素。根据上表显示，当多粘菌素浓度为4.0mg/ml时，基本能中和血清中的细菌内毒素0.015Eu/ml,使旁路反应，即使血液中存在细菌内毒素也不会影响鲎试剂中。进一步地，所述多粘菌素为多粘菌素E。专利技术人还提供了一种特异性检测血清中真菌的试剂制备方法，包括以下步骤：将多粘菌素、表面活性剂加入鲎试剂混合均匀，调节试剂pH值为5.5-6.5；所述多粘菌素的添加量为4.0mg/ml鲎试剂，所述表面活性剂的添加量为0.1％。进一步地，所述鲎试剂的制备过程包括以下步骤：细胞剪切：将鲎血细胞剪切后加入7-9倍的质量细胞崩解液，使细胞充分吸水膨胀后-10℃以下进行保存；细胞冻融：将细胞用冰水浴解冻后-10℃以下进行冻结，重复以上步骤5-8次；细胞液提取：将反复冻融后解冻的细胞离心提取上层细胞液；氯仿精制：将细胞液加入1.5-3倍质量的氯仿后，-10℃以下冻结混合物；将混合物置于冰水浴中解冻，解冻后离心提取的上清液即为鲎试剂。进一步地，所述多粘菌素为多粘菌素E，所述表面活性剂为Triton400。进一步地，所述制备过程在4℃以下进行。区别于现有技术，上述技术方案通过在鲎试剂内添加多粘菌素，多粘菌素含有带阳电荷的游离氨基，能与革兰氏阴性菌酯多糖(LPS)也就是细菌内毒素(endotoxin)的磷脂中带阴电荷的磷酸根结合，而使细菌内毒素失活，失活的脂多糖无法与鲎试剂中C因子起反应，从而阻断了C反应，避免了真菌检测中的假阳性结果。多粘菌素对鲎试剂中其他成分及检测血清中其他组分不会发生交叉反应。附图说明图1为
技术介绍
所述鲎试剂C、G反应体系图；图2为多粘菌素E结构图；图3为具体实施方式中，真菌(1-3)-β-D-葡聚糖检测试剂盒(终点显色基质法)的标准曲线图。具体实施方式为详细说明技术方案的
技术实现思路
、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。本实施方式所述的多黏菌素(Polymyxin)是发现于多黏类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)培养液中的抗菌性多肽，有A、B、C、D、E五种，多黏菌抗菌谱相互类似而范围宽广，特别对革兰氏阴性细菌作用颇强，毒性较弱。多黏菌素E(图2为多粘菌素E结构图)配合鲎试剂的血清试验：1.检测材料和方法1.1试剂真菌(1-3)-β-D-葡聚糖标准品(批号：20160601)、细菌内毒素国家标准品(批号：200707)、碱试剂、0.2mol/LPH6.0缓冲液、细菌内毒素检查用水(生产厂家：福州新北生化工业有限公司，批号：17050302细菌内毒素<0.005EU/ml)1.2仪器设备酶标仪(545nm波长)1台恒温振荡仪1台移液器(1000ul)1把移液器(200ul)1把旋涡混合器1台剪刀1把试管架2个1.3器具所有与试剂直接接触的器具应无菌无热原无葡聚糖。无热源枪头(1000ul)50支无热源枪头(200ul)(96支/盒×2)酶标板(96孔)(96孔/块×1)无热源空安瓿(2ml/支)10支/盒×20盒无菌无热源无任何添加剂的采血管100支/盒×1盒1.4血清材料1.4.1样本采集要求1.4.1.1采集过程要求无菌操作，用不加任何抗凝剂真空采血管。1.4.1.2健康人空腹采血。1.4.2样本的送检和保存要求1.4.2.1样本采集后应半小时内，于无添加抗凝剂的无热原无葡聚糖真空采血管中，3000转/分钟离心5分钟离心，取上层血清。1.4.2.2四小时内检测完。若当日不能及时检测样本应将离心后血浆转移至无热原采血管内2-8℃保存72小时内使用。-20℃以下冷冻保存，6个月内使用。2.实验方法2.1血清的外加标准品处理2.1.1标准品稀释真菌(1-3)-β-D-葡聚糖稀释：6400pg/mL→3200.0pg/mL内毒素稀释：100.000EU/mL→40.000EU/mL→20.000EU/mL2.1.2血清添加标准品2.1.2.1真菌(1-3)-β-D-葡聚糖：90μl血清+10μl3200.0pg/mL真菌(1-3)-β-D-葡聚糖溶液→100μl含320.0pg/mL真菌(1-3)-β-D-葡聚糖的血清(血清①)2.1.2.2血清添加内毒素：90μL血清+10μL20EU/mL内毒素溶液→100μL含2EU/mL内毒素的血清(血清②)2.1.2.3血清添加真菌(1-3)-β-D-葡聚糖与血清添加内毒素：180μl血清+10μl本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种特异性检测血清中真菌的试剂，其特征在于，所述试剂的组分包括多粘菌素和鲎试剂。

【技术特征摘要】
1.一种特异性检测血清中真菌的试剂，其特征在于，所述试剂的组分包括多粘菌素和鲎试剂。2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述多粘菌素的添加量为4.0mg/ml鲎试剂。3.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述多粘菌素为多粘菌素E。4.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述试剂的组分还包括表面活性剂，所述表面活性剂为Triton400。5.一种特异性检测血清中真菌的试剂制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将多粘菌素、表面活性剂加入鲎试剂混合均匀，调节试剂pH值为5.5-6.5；所述多粘菌素的添加量为4.0mg/ml鲎试剂，所述表面活性剂的添加量为0.1％。6.根据权利要求5所述的试剂制备方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁友玲，陈晓佳，李红玲，
申请(专利权)人：福州启新生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：福建,35