番茄SlCYP724B2基因及其应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体而言，本发明专利技术公开了一种提高番茄抗旱性和对细菌性斑点病抗性的基因SlCYP724B2，该基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。本发明专利技术还同时公开了上述基因编码的蛋白质，该蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。本发明专利技术还同时提供了上述基因或蛋白质在提高番茄抗旱性和提高番茄对细菌性斑点病抗性中的应用。

Tomato SlCYP724B2 gene and its application

The invention relates to the field of biotechnology. In particular, the invention discloses a gene SlCYP724B2 for improving drought resistance and bacterial spot resistance of tomato. The nucleotide sequence of the gene is shown as SEQ ID No:1. The present invention also discloses a protein encoded by the above gene, and the amino acid sequence of the protein is shown as SEQ ID No:2. The invention also provides the application of the above gene or protein in improving drought resistance and bacterial spot resistance of tomato.

【技术实现步骤摘要】
番茄SlCYP724B2基因及其应用
本专利技术涉及生物
，尤其是涉及番茄SlCYP724B2基因在干旱和对细菌性斑点病抗性中的应用。
技术介绍
番茄是全世界栽培最广泛的蔬菜作物之一，我国的番茄种植面积和产量都位居世界前列，番茄也是植物科学研究的重要模式植物，其在生产过程中受到各种非生物和生物胁迫的影响。番茄原产地在南美洲热带地区，属于需水量较多的一种蔬菜作物，番茄在生长过程中很容易受到干旱胁迫的影响，干旱导致番茄体内活性氧积累，光合作用减弱，细胞结构稳定性受到破坏，直接影响了番茄的生长发育和产量形成。尽管常规育种在提高番茄的抗旱性方面已经取得了很多进展，但由于抗旱性状的生理和遗传复杂性，在改善抗旱性或开发抗旱品种方面具有局限性，因此，通过生物技术和常规育种相结合的方法研究番茄对干旱的适应性及其机制，对解决干旱引起的番茄生理失调、产量损失具有重要意义。引起番茄细菌性斑点病的病原微生物为丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonassyringaepv.tomato)。丁香假单胞菌菌体为短杆状，有一至数根极生鞭毛，无荚膜、无芽孢的革兰氏阴性细菌。虽然也可在烟草、拟南芥中致病，但Pseudomonassyringaepv.tomato(Pst)是以番茄为主要宿主的丁香假单胞菌番茄致病变种。它对番茄的危害主要表现在叶片上，通常是从番茄的下位成熟叶片开始发病，开始发病时病斑形状是水滴大小的斑点，逐渐变成暗褐色直至变为黑褐色且病斑一直往上位叶蔓延。病害也可发生在叶脉上，沿着叶脉脉络不断发展，使叶片受损枯萎。另外，该病的发生降低了番茄产量和风味。因此，培育能够提高番茄对细菌性斑点病抗性的品种在生产上具有重要的意义。SlCYP724B2基因是番茄BR生物合成途径中的C22α-羟基化酶，属于细胞色素P450家族，体外实验的研究表明，CYP724B2在番茄BR生物合成途径中发挥C-22羟基化酶的作用，能够催化C27，C28，C29甾醇的羟基化，促进油菜素内酯的合成。通过对SlCYP724B2基因的克隆、转基因技术培育内源油菜素内酯含量升高的番茄材料，在提高番茄对非生物胁迫与生物胁迫的抗性方面，具有很好的应用前景。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种既能提高番茄抗旱性又能提高对细菌性斑点病抗性的基因以及蛋白质。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种调控番茄抗性和细菌性斑点病抗性的基因SlCYP724B2，该基因具有SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。本专利技术同时提供了一种上述基因编码的蛋白质，该蛋白质具有SEQIDNO：2所示的蛋白质序列。本专利技术还同时提供了含有上述基因的质粒以及含有上述基因的植物表达载体。本专利技术还同时提供了一种宿主细胞，该宿主细胞为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞。本专利技术还同时提供了上述基因的用途：用于构建转基因番茄，所述转基因番茄能够提高对干旱和对细菌性斑点病的抗性。本专利技术首次构建了番茄SlCYP724B2基因过表达和基因沉默转基因植株，并进行功能研究。通过干旱和PstDC3000接种实验，发现SlCYP724B2基因在番茄抗旱和抗细菌性病害中起到正向调控作用。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步详细说明。图1是SlCYP724B2基因过表达载体pGWB17::SlCYP724B2载体图谱。图2是SlCYP724B2基因沉默表达载体pBIN19::SlCYP724B2i载体图谱。图3是SlCYP724B2基因过表达和基因沉默的株系中SlCYP724B2基因的表达量。图4是SlCYP724B2基因过表达和基因沉默转基因植株对干旱的抗性表型。图5是SlCYP724B2基因过表达和基因沉默转基因植株干旱前后电导率变化。图6是SlCYP724B2基因过表达和基因沉默转基因植株对PstDC3000的抗性表型。图7是SlCYP724B2基因过表达和基因沉默转基因植株在PstDC3000侵染前后细菌生物量变化。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此：一、获得番茄SlCYP724B2基因全长序列：用PrimerPremier6.0设计全基因扩增引物，取种植在浙江大学紫金港校区温室的野生型番茄AC(AilsaCraig)叶片cDNA为模版(cDNA的提取方式为常规技术，例如可参照CN104561025A)，设计特异性引物SlCYP724B2-F和SlCYP724B2-R，用PrimerSTAR高保真酶PCR扩增SlCYP724B2片段。引物序列为：SlCYP724B2-F：5’-ATGGGTGAAGAAGGTAGTC-3’SlCYP724B2-R：5’-AGTAGAATTTTTATGAAGTCTG-3’PCR扩增反应体系：2xPrimerSTARbuffer25ul、dNTPMixture5ul、PrimerSTARDNApolymerase1ul、ddH2O16ul、cDNA1ul、上下游引物各1ul，共50ul。PCR反应程序为：94℃预变性90秒；94℃变性30秒，57℃退火45秒，72℃延伸1分钟，35个循环；最后72℃终延伸5分钟，将获得的PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，然后将扩增条带用AxygenDNA凝胶试剂盒回收纯化，将回收产物构建到pQB-V3载体上，将上述重组质粒送到擎科公司测序确认。所得的基因SlCYP724B2的核苷酸序列如SEQIDNo：1所示；该基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNo：2所示。二、SlCYP724B2基因过表达载体的构建SlCYP724B2过表达载体的构建，以pGWB17为终载体，构建具有CaMV35S重组型过表达启动子的pGWB17-35S::SlCYP724B2载体。利用LR反应将目的片段从pQB-V3初始载体中转移到带有pGWB17终载体上。使用LRIIEnzymemix(ThermoFisher)试剂盒，方法参照试剂盒中说明书。反应后将pGWB1735S::SlCYP724B2质粒转入大肠杆菌Top10感受态中。涂布法筛选，并用菌落PCR筛选出带有目的片段的pGWB17重组质粒(满足大小为1443bp条带的即为pGWB17重组质粒)，测序鉴定。用DNAMAN软件分析测序结果。正确转化子命名pGWB17::SlCYP724B2(图1)。三、SlCYP724B2基因RNAi沉默载体的构建RNAi干扰载体以pHANNIBAL为原始载体，通过PCR和酶切重组，构建CaMV35S启动子驱动下的SlCYP724B2发卡沉默单元。选取SlCYP724B2基因全长片段中约453bp的片段，确定该片段的序列没有编码的其它基因，以这样的序列作为RNA干扰的片段。最终利用原始载体pHANNIBAL和中间载体pBIN19共同的酶切位点SacⅠ&SpeⅠ酶切位点最终整合到植物双元载体pBIN19上。453bp的片段为：GGGTGAAGAAGGTAGTCTTTTGATAATTGTTATCACCCTAGTTTTTAGTTTTGTAATTGGCATAACATTAAACCATTTTTGGCCTTTGTTCTTCAATAATTATGGTACTACTCTTCATGTTAT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高番茄抗旱性和对细菌性斑点病抗性的基因SlCYP724B2，其特征在于：该基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种提高番茄抗旱性和对细菌性斑点病抗性的基因SlCYP724B2，其特征在于：该基因的核苷酸序列如SEQIDNo：1所示。2.如权利要求1所述的基因编码的蛋白质，其特征在于：该蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNo：2所示。3.一种含有权利要求1所述基因的质粒。4.一种含有权利要求1所述基因的植物表达载体。5.根据权利要求4所述的植物表达载体，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪俏梅，胡松申，周业凯，孟凡亮，邵志勇，刘浩然，陈珊珊，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33