鸡性腺原始生殖细胞快速分离与建系的方法技术

本发明专利技术公开了一种鸡性腺原始生殖细胞快速分离与建系的方法，从7日龄鸡胚的性腺中分离、纯化原始生殖细胞，并将分离到的原始生殖细胞利用culture insert配合饲养层的方法，利用优化的培养系统，在15天内扩增获得100万以上细胞，实现快速扩增建系。本发明专利技术具有成功率高、时间短、稳定高效的特征，并可在15d内扩增获得106以上细胞，为家禽种质资源保存和转基因鸡制备研究奠定了基础。

Rapid isolation and establishment of gonad primordial germ cells in chicken

The invention discloses a method for rapid isolation and establishment of chicken gonad primordial germ cells. The primordial germ cells are isolated and purified from the gonads of 7-day-old chicken embryos. The cultured primordial germ cells are amplified to more than 1 million in 15 days by culture insert with feeder layer and optimized culture system. Cells, to achieve rapid amplification. The invention has the characteristics of high success rate, short time, stability and high efficiency, and can amplify more than 106 cells within 15 days, which lays a foundation for the conservation of poultry germplasm resources and the preparation of transgenic chicken.

【技术实现步骤摘要】
鸡性腺原始生殖细胞快速分离与建系的方法
本专利技术属于动物生殖干细胞的体外分离、培养、建系
，尤其涉及一种鸡性腺原始生殖细胞快速分离与建系的方法。
技术介绍
生殖干细胞是具有产生配子能力的一群具有自我更新以及分化能力的多能干细胞。生殖干细胞在早期胚胎中开始出现，迁移到生殖脊形成性腺，并最终构成动物生殖器官的重要组成部分。在动物繁殖育种过程中，生殖干细胞扮演着重要的角色，不仅在动物早期胚胎发育中起到重要作用，在机体发育成熟后产生配子的过程中，其自我更新能力与分化能力的维持也对精子发生、卵子起着决定性的作用。生殖干细胞的相关研究，有利于生殖类疾病发生机理的发现与治疗，在动物繁殖育种工作中，对优质种质资源的保存及推广、珍稀动物种质资源的保护以及转基因动物的研制等方面都有着极高的价值。原始生殖细胞是在动物胚胎时期出现的一种具有多能性的生殖干细胞，也是动物出生后体内的精原干细胞或者卵原干细胞的前体细胞。鸡原始生殖细胞的分离及体外培养的几种方法已经获得成功。RobertJ等从14-17期的鸡胚中取少量血液，以BRL细胞作为饲养层，以一种KO-DMEM为底液的培养基培养，成功分离并长期培养具有生殖系传递能力的原始生殖细胞(vandeLavoir，M.C.，Diamond，J.H.，Leighton，P.A.，Mather-Love，C.，Heyer，B.S.，Bradshaw，R.，...Etches，R.J.(2006).Germlinetransmissionofgeneticallymodifiedprimordialgermcells.Nature，441(7094)，766-769.doi：10.1038/nature04831)。而Han等以相似的方法，用KO-DMEM为底液的另一种培养基也成功分离并体外培养鸡的原始生殖细胞，且维持原始生殖细胞的细胞特性并具有性腺迁移能力(Park&Han，J.Y.(2012).piggyBactranspositionintoprimordialgermcellsisanefficienttoolfortransgenesisinchickens.ProcNatlAcadSciUSA，109(24)，9337-9341.doi：10.1073/pnas.1203823109)。然而，这些方法获得原始生殖细胞的建系成功率低(约5％-30％)、建系时间长(30-60d)，且培养体系都具有不稳定性和低效性。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种成功率高、时间短、稳定高效的鸡性腺原始生殖细胞快速分离与建系的方法。为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：鸡性腺原始生殖细胞快速分离与建系的方法，从7日龄鸡胚的性腺中分离、纯化原始生殖细胞，利用cultureinsert配合饲养层的方法，将原始生殖细胞置于优化的培养液进行培养，实现快速扩增建系；优化的培养液组成为KO-DMEM，0.2％鸡血清，1％胎牛血清，1.2mM丙酮酸钠，100ug/ml肝素钠，1Xantibiotic-antimycotic，1XGlutaMax，1XGSnucleosidesupplement，0.1mMb-巯基乙醇，4ng/mlhFGFb，1XNEAA，1XB-27VitaminA，25ng/mlHumanActivinA。培养液在原代培养时2-3d进行半量换液。上述鸡性腺原始生殖细胞快速分离与建系的方法，包括以下步骤：<1>鸡胚的准备；<2>原始生殖细胞的分离；<3>原始生殖细胞的纯化；<4>原始生殖细胞细胞的原代培养；<5>原始生殖细胞传代培养和建系。步骤<1>按以下操作进行：将受精种蛋在孵化箱内进行孵化，到第七天时取用。步骤<2>按以下操作进行：取出7天胚龄鸡胚，将性腺分离，转移到事先准备的预热30μL的PBS液滴中洗涤，重复洗涤两次后，以1对性腺为一组，移入装有20μL0.05％的胰酶的500μL的离心管中，37℃水浴消化8分钟，用200μL普通成纤维细胞培养液终止消化，并轻轻吹打至性腺组织块成为细胞悬液。步骤<3>按以下操作进行：转移细胞悬液到24孔板中，37℃，5％CO2培养4h，收集未贴壁细胞到15ml的离心管中，每5对性腺为一组，用原始生殖细胞培养液重悬细胞，转移到30mm的细胞培养皿中，培养皿上已铺好饲养层，并提前30min置入cultureinsert中。步骤<4>按以下操作进行：用原始生殖细胞培养液培养，每2d进行半量换液，每4-5d更换MEF饲养层。MEF饲养层提前用15g/ml的丝裂霉素C处理2h。步骤<5>按以下操作进行：将以上培养的原始生殖细胞在培养至第8d时，更换cultureinsert，以1∶2到1∶3的比例传代到含有新饲养层的培养基中，每1-2d进行半量换液。鸡为白羽鸡、广西三黄鸡、东兰乌鸡。针对现有鸡原始生殖细胞分离及建系存在的问题，专利技术人建立了一种鸡性腺原始生殖细胞快速分离与建系的方法，从7日龄鸡胚的性腺中分离、纯化原始生殖细胞，利用cultureinsert配合饲养层的方法，将原始生殖细胞置于优化的培养液进行培养，实现快速扩增建系。试验表明，本专利技术成功率高、时间短、稳定高效，建系的细胞表达生殖干细胞特异性标记，并保持良好的性腺迁移能力，为家禽种质资源保存和转基因鸡制备研究奠定了基础。具体而言，本专利技术的突出优势在于：(1)本专利技术适用于鸡等家禽的原始生殖细胞的分离、纯化及培养。所分离的原始生殖细胞为典型的单个圆形细胞，细胞体积较一般细胞偏大，光滑透亮，SSEA1、DAZL染色为阳性，仍保持原始生殖细胞的特性。(2)本专利技术具有简单、高效的特点，可在15d内扩增获得106以上细胞。(3)本专利技术具有稳定性和高效性，在针对不同品种的鸡PGCs的分离建系实验中，建系成功率高达80％-90％。附图说明图1是本专利技术分离纯化后的原始生殖细胞图，图中：左为分离纯化后的鸡原始生殖细胞(100倍)，右为分离后的鸡原始生殖细胞(200倍)。图2是本专利技术纯化原始生殖细胞后放入cultureinsert中的细胞形态图。图3是本专利技术在扩增细胞时处于快速增殖状态中的细胞。图4是本专利技术成功建系后的细胞进行SSEA1染色鉴定图，图中：4-a，SSEA-1染色细胞的明场图；4-b，SSEA1免疫荧光阳性细胞；4-c，DAPI对细胞核的免疫荧光染色；4-d，DAPI与SSEA-1染色的Merge图；下方四图则为单染DAPI的二抗对照组图片，依次为：4-e，二抗对照染色细胞的明场图；4-f，二抗免疫荧光染色对照；4-gDAPI对细胞核的免疫荧光染色；4-h，DAPI与二抗对照染色的Merge图；。图5是本专利技术对原始生殖细胞进行绿色荧光蛋白转染后初步纯化的细胞系图，图中：左为EGFP慢病毒转导PGC的明场图；中为EGFP慢病毒转导PGC的绿色荧光图；右为EGFP慢病毒转导PGC的Merge图。图6是本本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鸡性腺原始生殖细胞快速分离与建系的方法，其特征在于：从7日龄鸡胚的性腺中分离、纯化原始生殖细胞，利用culture insert配合饲养层的方法，将原始生殖细胞置于优化的培养液进行培养，实现快速扩增建系；所述优化的培养液组成为KO‑DMEM，0.2％鸡血清，1％胎牛血清，1.2mM丙酮酸钠，100ug/ml肝素钠，1X antibiotic‑antimycotic，1X GlutaMax，1XGS nucleoside supplement，0.1mM b‑巯基乙醇，4ng/ml hFGFb，1X NEAA，1X B‑27Vitamin A，25ng/ml Human Activin A。

【技术特征摘要】
1.一种鸡性腺原始生殖细胞快速分离与建系的方法，其特征在于：从7日龄鸡胚的性腺中分离、纯化原始生殖细胞，利用cultureinsert配合饲养层的方法，将原始生殖细胞置于优化的培养液进行培养，实现快速扩增建系；所述优化的培养液组成为KO-DMEM，0.2％鸡血清，1％胎牛血清，1.2mM丙酮酸钠，100ug/ml肝素钠，1Xantibiotic-antimycotic，1XGlutaMax，1XGSnucleosidesupplement，0.1mMb-巯基乙醇，4ng/mlhFGFb，1XNEAA，1XB-27VitaminA，25ng/mlHumanActivinA。2.根据权利要求1所述的鸡性腺原始生殖细胞快速分离与建系的方法，其特征在于：所述培养液在原代培养时2-3d进行半量换液。3.根据权利要求1所述的鸡性腺原始生殖细胞快速分离与建系的方法，其特征在于包括以下步骤：<1>鸡胚的准备；<2>原始生殖细胞的分离；<3>原始生殖细胞的纯化；<4>原始生殖细胞细胞的原代培养；<5>原始生殖细胞传代培养和建系。4.根据权利要求1所述的鸡性腺原始生殖细胞快速分离与建系的方法，其特征在于步骤<1>按以下操作进行：将受精种蛋在孵化箱内进行孵化，到第七天时取用。5.根据权利要求1所述的鸡性腺原始生殖细胞快速分离与建系的方法，其特征在于步骤<2>按以下操作进行...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆阳清，谢龙，陆振萍，陈东阳，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：广西,45