一株铜绿假单胞菌及其筛选方法与其在秸秆乳酸发酵中的应用技术

技术编号:18650129 阅读:27 留言:0更新日期:2018-08-11 11:35
本发明专利技术提供了一株铜绿假单胞菌,其保藏编号为CCTCC NO:M2018169;本发明专利技术还提供了该株铜绿假单胞菌的筛选方法及其在秸秆乳酸发酵中的应用;该株铜绿假单胞菌是从市政污水处理厂的好氧池活性污泥中筛选得到,可高效降解木质素在预处理过程中产生的多种典型产物,37℃条件下培养36小时,对各底物香豆酸、对羟基苯甲醛、香兰素、阿魏酸、丁香醛的降解率均达到100%;利用该株铜绿假单胞菌进行秸秆乳酸发酵,可避免这些典型产物抑制秸秆乳酸发酵时的微生物代谢,从而提高乳酸对秸秆转化率,且发酵周期短,培养48‑72h则发酵结束,利用植物秸秆做发酵原料,变废为宝,降低环境污染,对保证粮食安全具有积极意义。

A Pseudomonas aeruginosa and its screening method and its application in straw lactic acid fermentation

The invention provides a strain of Pseudomonas aeruginosa, its preservation number is CCTCC NO: M2018169; the invention also provides a screening method of the strain of Pseudomonas aeruginosa and its application in straw lactic acid fermentation; the strain of Pseudomonas aeruginosa is screened from aerobic tank activated sludge of municipal sewage treatment plant and can degrade wood efficiently. The degradation rates of coumaric acid, p-hydroxybenzaldehyde, vanillin, ferulic acid and eugenol reached 100% after 36 hours incubation at 37 C. The strain of Pseudomonas aeruginosa was used to ferment straw lactic acid to avoid the inhibition of these typical products on straw lactic acid. Microbial metabolism during fermentation can improve the conversion rate of lactic acid to straw, and the fermentation period is short. The fermentation is over after 48 to 72 hours of cultivation. Using plant straw as fermentation material, waste is turned into treasure and environmental pollution is reduced, which is of positive significance to ensure food security.

【技术实现步骤摘要】
一株铜绿假单胞菌及其筛选方法与其在秸秆乳酸发酵中的应用
本专利技术涉及微生物学及秸秆乳酸发酵领域,尤其涉及铜绿假单胞菌及其筛选方法、以及铜绿假单胞菌在秸秆乳酸发酵中的应用。
技术介绍
中国是农业大国,每年农作物秸秆的产量超过8亿吨。农作物秸秆主要被用作还田、青贮和黄贮饲料、沼气、生物炭、生物质燃料及生物能源等方面,但秸秆直接还田腐熟慢,对耕地质量提高不明显;作为青贮或黄贮饲料,生产周期长,饲料转化率不高;秸秆发酵产沼气会产生大量沼液和沼渣,秸秆的大量焚烧导致严重的雾霾。总而言之,农作物秸秆资源被大量利用,却仍然存在利用率低,二次污染等诸多问题。将农作物秸秆资源通过微生物发酵转化为乳酸等产品,是实现秸秆资源高效利用的一种新途径。乳酸是一种羟基羧酸,被广泛用于食品行业(防腐剂、调味剂),医药行业(软膏、乳液、注射剂)和皮革行业(酸化剂、除钙剂)。在食品工业上广泛用作酸味剂、防腐剂和还原剂。乳酸的工业生产以微生物发酵为主,以玉米等粮食作物为原料,这就导致乳酸价格居高不下,同时对国家粮食安全构成潜在的威胁。秸秆的主要成分中的纤维素、半纤维素通过酶解可转化为六碳糖和五碳糖,微生物的同型乳酸发酵过程,乳酸对糖的理论转化率为100%。所以,以农作物秸秆为原料生产乳酸,既可以实现秸秆资源的高效利用,提高秸秆的经济价值,又可以为乳酸的生产开辟新思路,提供更广泛更廉价的原料,降低乳酸生产成本,拓展乳酸的应用领域,一举两得。对比文件1:申请号为“CN201010609278.0”,名称为“一种乳酸菌发酵方法”的专利,该专利技术利用植物秸秆纤维素部分酶解后作为乳酸菌发酵用碳源发酵生产乳酸,其中,所述的植物秸秆纤维素部分酶解后的糖浓度为1wt%~10wt%,所述的部分酶解是将植物秸秆纤维素在45~55℃,用纤维素酶酶解12~72小时,使发酵液中既含有酶解糖,又含有未酶解的纤维素,从而可以边酶解边发酵生产乳酸。同现有技术相比生产周期由136小时缩短到64小时,解除了高浓度葡萄糖对乳酸菌发酵乳酸的抑制作用,发酵水平由3.6wt%提高到6.8wt%。利用植物秸秆做发酵原料,变废为宝,降低环境污染,对保证粮食安全具有积极意义。然而该专利技术乳酸对秸秆转化率尚不高,农作物秸秆需要经过预处理才能被微生物利用,而秸秆在预处理过程中,会产生多种副产物,抑制微生物的代谢,其主要来源是木质素和半纤维素的分解,包括小分子有机酸类、呋喃类和酚类等。大多数微生物都不能利用木质素,而木质素及其部分降解产物在发酵过程中会吸附纤维素酶,形成共沉淀,使其活性降低至丧失;木质素分解产生阿魏酸、松柏醛等酚类化合物,提高微生物细胞膜的流动性,导致钾离子大量流失,破坏细胞膜,抑制微生物的代谢,从而影响乳酸对秸秆转化率。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术之缺陷,提供了一株铜绿假单胞菌及其筛选方法与其在秸秆乳酸发酵中的应用,该株铜绿假单胞菌是从市政污水处理厂的好氧池活性污泥中筛选得到,可高效降解木质素在预处理过程中产生的多种典型产物,避免这些典型产物抑制秸秆乳酸发酵时的微生物代谢,从而提高乳酸对秸秆转化率,且发酵周期短,利用植物秸秆做发酵原料,变废为宝,降低环境污染,对保证粮食安全具有积极意义。本专利技术的目的之一在于提供了一株铜绿假单胞菌,本专利技术的铜绿假单胞菌(Bacillussubtilis),其命名为铜绿假单胞菌FL02,从市政污水处理厂的好氧池活性污泥中筛选得到。菌株FL02的16SrRNA序列如SEQIDNO:1所示,利用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3')经PCR扩增该菌株的16SrRNA基因。将16SrRNA序列在GenBank中序列分析及同源性比较,通过比对菌株FL02与铜绿假单胞菌的相似性为99%。总之,经过对菌株的形态学鉴定、生理生化实验和16SrRNA序列分析及同源性比较,因此确定菌株铜绿假单胞菌FL02为铜绿假单胞菌。基于以上信息,将菌株FL02鉴定为铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)该菌现已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),地址:湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内,武汉大学保藏中心,邮编:430072,保藏编号CCTCCNO:M2018169,保藏日期2018年3月30日。本专利技术的目的之二在于提供该株铜绿假单胞菌的筛选方法,其包括以下步骤:步骤1、在培养瓶中加入富集培养基,再依次加入水处理厂二沉池污泥、印染厂出水口附近土壤,封口后震荡培养后得到富集培养液,所述富集培养基包括香兰素、对羟基苯甲醛、丁香醛和酵母浸粉;步骤2、在培养瓶中装好筛选培养基,加入所述步骤1得到的富集培养液,封口后震荡培养,得到筛选种子液,所述筛选培养基包括香兰素、对羟基苯甲醛、丁香醛、愈创木酚、阿魏酸、香豆酸、酵母浸粉、MgSO47H2O、CaCl2、(NH4)2SO4、K2HPO4、NaCl和FeCl3;步骤3、将步骤2所得的筛选种子液经过梯度稀释后,涂布于固体筛选培养基平板上,静置培养后,挑取长好的单菌落;步骤4、将步骤3中挑取得到的单菌落保藏并做16SrDNA鉴定,鉴定结果为铜绿假单胞菌。本专利技术的目的之三在于提供该株铜绿假单胞菌在秸秆乳酸发酵中的应用。作为该株铜绿假单胞菌在秸秆乳酸发酵中的应用的具体实施方式,其包括以下步骤:步骤S1、玉米秸秆预处理:称取玉米秸秆于铝箔袋中,加入浓氨水,迅速封口,反复揉铝箔袋使NH3与秸秆充分接触,常温下放置三天以上,即可得到氨处理秸秆;步骤S2、秸秆乳酸发酵:在培养瓶中装所述步骤S1得到的预处理玉米秸秆,同时接种凝结铜绿假单胞菌和权利1所述的铜绿假单胞菌,添加复合纤维素酶作为底物,静置发酵培养后即得乳酸成品。本专利技术具有以下有益效果:1、本专利技术提供的该株铜绿假单胞菌可高效降解木质素在预处理过程中产生的多种典型产物,如对羟基苯甲醛、香豆酸、香兰素、阿魏酸、丁香醛,铜绿假单胞菌FL02可以上述化合物为唯一碳源,150r/min,37℃条件下培养36小时,对各底物香豆酸、对羟基苯甲醛、香兰素、阿魏酸、丁香醛的降解率均达到100%。2、本专利技术提供的该株铜绿假单胞菌可高效降解木质素在预处理过程中产生的多种典型产物,避免这些典型产物抑制秸秆乳酸发酵时的微生物代谢,从而提高乳酸对秸秆转化率,秸秆乳酸发酵实验中乳酸对秸秆转化率高达65%;3、本专利技术提供的该株铜绿假单胞菌在秸秆乳酸发酵中的应用,发酵周期短,37℃条件下培养36小时可完全降解所述多种典型产物,培养48-72h则发酵结束;4、本专利技术利用植物秸秆做发酵原料,变废为宝,降低环境污染,对保证粮食安全具有积极意义。本专利技术的菌株保藏日期为2018年3月30日,保藏编号为CCTCCNO:M2018169,分类命名为Pseudomonasaeruginosa,保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心(CCTCC),地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内。具体实施方式实施例1菌株FL02的筛选1、在250ml三角瓶中加入90ml富集培养基(1g/L香兰素+1g/L对羟基苯甲醛+1g/L丁香醛+1g/L酵母浸粉,pH7.0),再分别加入水处理厂二沉池污泥、本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一株铜绿假单胞菌,其特征在于,其命名为铜绿假单胞菌FL02,其保藏编号为CCTCCNO:M2018169。

【技术特征摘要】
1.一株铜绿假单胞菌,其特征在于,其命名为铜绿假单胞菌FL02,其保藏编号为CCTCCNO:M2018169。2.一种权利要求1所述的铜绿假单胞菌的筛选方法,其特征在于,其包括以下步骤:步骤1、在培养瓶中加入富集培养基,再依次加入水处理厂二沉池污泥、印染厂出水口附近土壤,封口后震荡培养后得到富集培养液,所述富集培养基包括香兰素、对羟基苯甲醛、丁香醛和酵母浸粉;步骤2、在培养瓶中装好筛选培养基,加入所述步骤1得到的富集培养液,封口后震荡培养,得到筛选种子液,所述筛选培养基包括香兰素、对羟基苯甲醛、丁香醛、愈创木酚、阿魏酸、香豆酸、酵母浸粉、MgSO47H2O、CaCl2、(NH4)2SO4、K2HPO4、NaCl和FeCl3;步骤3、将步骤2所得的筛选种子液经过梯度稀释后,涂布于固体筛选培养基平板上,静置培养后,挑取长好的单菌落;步骤4、将步骤3中挑取得到的单菌落保藏并做16SrDNA鉴定,鉴定结果为铜绿假单胞菌。3.如权利要求2所述的铜绿假单胞菌的筛选方法,其特征在于,所述富集培养基配方为1g/L香兰素+1g/L对羟基苯甲醛+1g/L丁香醛+1g/L酵母浸粉,pH7.0。4.如权利要求2所述的铜绿假单胞菌的筛选方法,其特征在于,所述筛选培养基的配方为1g/L香兰素+1g/L对羟基苯甲醛+1g/L丁香醛+1g/L愈创木酚+1g/L阿魏酸+1g/L香豆酸+0.5g/L酵母浸粉+0.2g/LMgSO47H2O+0.1g/LCaCl2,1g/L(NH4)2SO4+1g/LK2HPO4+0.1g/LNaCl+0.02g/LFeCl3,pH7.0。5.如权利要求2所述的铜绿假单胞菌的筛选方法,其特征在于,所述步骤1中,在250ml三角瓶中加入90ml富集...

【专利技术属性】
技术研发人员:胡金龙彭楠李红蔡玉缘谢月娇周文兵梁运祥朱端卫
申请(专利权)人:华中农业大学
类型:发明
国别省市:湖北,42

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