本发明专利技术公开了一种热稳定性埃博拉治疗性抗体的制备及应用。本发明专利技术提供了一种埃博拉病毒抗体的制备方法，包括如下步骤：采用重组病毒免疫禽类动物，得到所述抗体；所述重组病毒是采用埃博拉病毒糖蛋白替换水疱性口炎病毒的糖蛋白得到的重组病毒。采用本发明专利技术的方法制备的高免抗体可在室温稳定保存一年时间，无需冷链运输和保存，因此更适合非洲基础设施薄弱地区的应用。
Preparation and application of a thermostable Ebola therapeutic antibody
The invention discloses the preparation and application of a heat stable Ebola therapeutic antibody. The present invention provides a preparation method of Ebola virus antibody, including the following steps: the recombinant virus is used to immunization poultry animals to obtain the antibody; the recombinant virus is a recombinant virus obtained by using the glycoprotein of Ebola virus glycoprotein to replace the glycoprotein of the blisters stomatitis virus. The high free antibody prepared by this method can be kept stable at room temperature for a year without cold chain transportation and preservation, so it is more suitable for the application of weak infrastructure in Africa.
【技术实现步骤摘要】
一种热稳定性埃博拉治疗性抗体的制备及应用
本专利技术涉及一种热稳定性埃博拉治疗性抗体的制备及应用。
技术介绍
埃博拉病毒(Ebolavirus，EBOV)是烈性传染病埃博拉出血热(Ebolahemorrhagicfever，EHF)的病原体。该病毒于1976年首次被发现，1995年在刚果民主共和国爆发后才被人们所认知，2014-15年西非大规模疫情的爆发，让全球开始关注埃博拉病毒。埃博拉病毒感染性极强，传播途径包括体液、接触及气溶胶，可通过野生动物传播给人，并在人与人之间传播蔓延。世界卫生组织已将其列为对人类危害最严重的病毒之一，在生物安全等级上被列为最危险的第4级病毒。2012年有研究证明，将幸存的感染过埃博拉病毒的非人灵长动物血清注入多个动物，可使这些动物抵御致死剂量埃博拉病毒的攻击，提示埃博拉病毒抗血清具有治疗埃博拉感染的潜力。后来有研究人员尝试将多个抗埃博拉病毒糖蛋白(EBOV-GP)的单克隆抗体混合后，用于治疗埃博拉病毒感染病毒，也证明了一定的治疗效果。我国军科院的研究人员采用埃博拉病毒样颗粒(VLP)作为免疫原，免疫马匹制备了高免血清，注入小鼠体内，可使感染埃博拉病毒鼠适应株的小鼠存活。这些研究对于埃博拉的抗体治疗提供了依据和基础。埃博拉病毒主要流行于非洲，而且主要在雨林或偏远的草原地区。由于偏远地区基础设施滞后、人才不足、资金短缺，缺乏基本的公共卫生保障体系，而且电力供应严重不足，缺乏必要的冷链运输。尽管埃博拉病毒单克隆抗体和马高免血清对于埃博拉病毒感染具有一定的治疗效果，但由于这些抗体需要严格的冷链运输和保存要求，否则极易丢失活性，因此在条件恶劣的非洲应用受到了限制。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种热稳定性埃博拉治疗性抗体的制备及应用。本专利技术提供了一种埃博拉病毒抗体的制备方法，包括如下步骤：采用重组病毒免疫禽类动物，得到所述抗体；所述重组病毒是采用埃博拉病毒糖蛋白替换水疱性口炎病毒的糖蛋白得到的重组病毒。所述禽类动物具体可为鸡，更具体可为120日龄蛋鸡。所述重组病毒是采用埃博拉病毒糖蛋白编码基因替换水疱性口炎病毒基因组中的糖蛋白编码基因得到的重组病毒。所述埃博拉病毒糖蛋白如序列表的序列2所示。所述埃博拉病毒糖蛋白编码基因如序列表的序列1所示。所述水疱性口炎病毒基因组序列如GenBank：J02428.1所示。所述重组病毒的制备方法具体包括如下步骤：将主质粒VSV-EBOVGP、辅助质粒pCAGGS-N、辅助质粒pCAGGS-P、辅助质粒pCAGGS-L和辅助质粒pCAGGS-T7共转染Vero和293T混合细胞，72h后收集细胞上清液，将上清液重新感染Vero细胞并连续传代直到形成明显细胞病变，收获上清病毒液并进行标定，得到重组病毒。所述主质粒VSV-EBOVGP、辅助质粒pCAGGS-N、辅助质粒pCAGGS-P、辅助质粒pCAGGS-L和辅助质粒pCAGGS-T7的质量比为6.5μg：10μg：10μg：10μg：10μg。所述主质粒VSV-EBOVGP的构建方法为：人工合成VSV全基因组序列(GenBank：J02428.1)，并将VSV基因组中的糖蛋白编码基因(基因组位置：3049-4713)替换为埃博拉病毒糖蛋白编码基因(序列表的序列1)，基因组序列5’端连接T7启动子序列(TAATACGACTCACTATAGG)，基因组序列3’端连接序列3中的序列(包含T7终止子和核糖酶编码序列)，将合成的序列通过NdeI/XhoI酶切位点克隆入pcDNA3质粒。所述辅助质粒pCAGGS-N的构建方法为：将VSV基因组中的N蛋白编码基因(基因组位置：64-1332)通过EcoRI-XhoI酶切位点克隆入真核表达质粒PCAGGS。所述辅助质粒pCAGGS-P的构建方法为：将VSV基因组中的P蛋白编码基因(基因组位置：1396-2193)通过EcoRI-XhoI酶切位点克隆入真核表达质粒PCAGGS。所述辅助质粒pCAGGS-L的构建方法为：将VSV基因组中的L蛋白编码基因(基因组位置：4733-11062)通过EcoRI-XhoI酶切位点克隆入真核表达质粒PCAGGS。所述辅助质粒pCAGGS-T7的构建方法为：将T7RNA聚合酶编码基因(GenBank：M38308.1)通过EcoRI-XhoI酶切位点克隆入真核表达质粒PCAGGS。所述埃博拉病毒抗体的制备方法中，所述免疫分为四次，每次间隔两周，每次的免疫剂量为103TCID5o-104TCID50。每次的免疫剂量最佳为104TCID50。所述免疫方式为肌肉注射。所述埃博拉病毒抗体的制备方法中，所述免疫完成后，还包括如下步骤：(1)采集卵黄，将卵黄与蒸馏水混合混合，pH调至5.2，静置10小时，离心收集上清，加入正辛酸溶液，过滤除去沉淀，取上清液；(2)将步骤(1)得到的上清液超滤浓缩10倍，浓缩液经过凝胶过滤层析柱Superdex20，收集目的蛋白(卵黄抗体)溶液；将目的蛋白(卵黄抗体)溶液冻干，得到所述抗体。所述埃博拉病毒抗体的制备方法中，所述免疫完成后，还包括如下步骤：(1)采集卵黄，将1体积份的卵黄与8体积份的与蒸馏水混合，pH调至5.2，静置10小时，10000g离心15分钟收集上清，加入1％(体积百分比)正辛酸水溶液，过滤除去沉淀，取上清液；(2)将步骤(1)得到的上清液经XL小型切向流超滤膜包(密理博)超滤浓缩10倍，将PBS(pH7.2)以2mL/min流速持续流经凝胶过滤层析柱Superdex200(GE生命科学，货号：17-5175-01)，注入浓缩抗体，收集目的蛋白(卵黄抗体)溶液；将目的蛋白(卵黄抗体)溶液冻干，得到所述抗体。本专利技术还保护以上任一所述的方法制备得到的埃博拉病毒抗体。本专利技术还保护埃博拉病毒抗体在制备抗埃博拉病毒的产品中的应用。本专利技术还保护一种抗埃博拉病毒的产品，其活性成分为所述埃博拉病毒抗体。本专利技术提供了一种具有高度热稳定性的埃博拉病毒高免抗体的制备方法，制备的高免抗体可在室温稳定保存一年时间，无需冷链运输和保存，因此更适合非洲基础设施薄弱地区的应用。附图说明图1为实施例2中最优免疫原筛选结果。图2为实施例3中抗体热稳定性检测结果。图3为实施例4中动物保护实验检测结果。图4为实施例5中动物体内代谢动力实验检测结果。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例1、免疫原的制备一、重组埃博拉病毒糖蛋白1、重组质粒的制备：将2014年埃博拉病毒流行毒株糖蛋白编码基因(序列表的序列1，编码序列2所示的蛋白质)插入pFast-Bac1载体的BamHI和XhoI酶切位点之间，得到重组质粒(已经测序验证)。2、将步骤1得到的重组质粒转染sf9昆虫细胞株，收集并标定重组杆状病毒。pFast-Bac1载体、sf9昆虫细胞株均来自杆状病毒表达系统(BaculovimsExpressionSystem，美国invitrogen公司)，重组杆状病毒的制备方法参照杆状病毒表达系统使用说明书。3、将步骤2制备本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种埃博拉病毒抗体的制备方法，包括如下步骤：采用重组病毒免疫禽类动物，得到所述抗体；所述重组病毒是采用埃博拉病毒糖蛋白替换水疱性口炎病毒的糖蛋白得到的重组病毒。
【技术特征摘要】
1.一种埃博拉病毒抗体的制备方法，包括如下步骤：采用重组病毒免疫禽类动物，得到所述抗体；所述重组病毒是采用埃博拉病毒糖蛋白替换水疱性口炎病毒的糖蛋白得到的重组病毒。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述禽类动物为鸡。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述重组病毒是采用埃博拉病毒糖蛋白编码基因替换水疱性口炎病毒基因组中的糖蛋白编码基因得到的重组病毒。4.如权利要求1至3任一所述的方法，其特征在于：所述埃博拉病毒糖蛋白如序列表...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨利敏，刘文军，魏艳秋，范文辉，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11
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