酶促样品纯化制造技术

技术编号:18609049 阅读:6 留言:0更新日期:2018-08-04 22:43
酶促纯化方法涉及将包含靶分析物和氨基酸的样品引入反应室的多孔基质中。所述反应室包括第一孔和第二孔。所述第一孔含有与氨基酸反应以形成多肽的多肽合成酶。第一孔具有可由氨基酸进入、但不可由随后形成的多肽进入的第一尺寸。所述第二孔具有比第一尺寸更大的第二尺寸,与第一孔接触并形成从反应室内延伸至废物室的系列。形成的多肽通过一系列第二孔迁移至废物室。从所述反应室提取所述样品的靶分析物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】酶促样品纯化背景经常分析复杂样品,诸如血液、血清、细胞裂解物、细胞外液、乳和其他生物流体以鉴定样品内的分析物或表征样品内的分析物。鉴定或表征此类复杂样品的多个分子中的分析物经常是困难且耗时的。附图简述图1是实例酶促样品纯化系统的示意图。图2是实例酶促样品纯化方法的流程图。图3是实施图2的实例方法的实例酶促样品纯化系统的图。图4是实例酶促样品纯化系统的示意图。图5是实例酶促样品纯化系统的示意图。实例的详述本文公开了利用酶以促进用于分析的样品的更快且成本更低的制备的酶促样品纯化系统和方法的不同实例。许多复杂样品诸如血液、血清、细胞裂解物、细胞外液、乳和其他生物流体都含有蛋白的降解产物,诸如氨基酸和肽,其干扰复杂样品中靶分析物的检测和感测。因为蛋白降解产物可以具有与许多靶分析物的类似的尺寸和其他特性,所以此类蛋白降解产物的分离和去除可能是困难的。实例酶促样品纯化系统和方法利用与蛋白降解产物反应以形成尺寸大得多的多肽的酶。实例酶促样品纯化系统和方法利用具有不同尺寸的孔的多孔基质。较小的孔含有多肽合成酶,同时将来自接收的样品的靶分析物熵驱动地(entropically)保留在反应室内。较大的孔形成一系列孔以在反应室内形成多肽通道,并且通过所述多肽通道,由酶和蛋白降解产物的反应产生的形成的多肽行进至废物室,将具有靶分析物的纯化样品留在反应物内用于随后的提取和分析。形成的多肽向废物室的运输在反应室中产生非平衡状态,增强酶和剩余蛋白降解产物的进一步反应。增强的反应形成额外的多肽,其通过反应室中的多肽通道继续行进至废物室。循环继续,用于样品的增强纯化。图1示意性说明实例酶促样品纯化系统20,其可以促进更快速、成本更低且更有效地纯化样品用于分析。系统20通过利用与蛋白降解产物反应以形成尺寸大得多的多肽的多肽合成酶来纯化样品。如下文将描述,系统20促进形成的多肽向废物室的连续迁移或运输,使得在反应室内持续非平衡状态。反应室内的持续非平衡状态增强剩余蛋白降解产物与酶的进一步反应以形成额外的多肽,其也移出反应室,将具有其靶分析物的更纯化的样品留在反应室中。为了在反应室内产生持续的非平衡状态,系统20利用不同尺寸的孔的多孔基质和由基质的较大孔形成的多肽通道,以促进形成的多肽连续运输出反应室并进入废物室。同时,一定数量的较小孔熵驱动地诱捕或保留反应室内的靶分析物,其与已运输至废物室的多肽(和PDP)分离。这种熵驱动的诱捕是大量较小孔的结果,所述较小孔为较小的靶分析物提供了长得多、弯曲和迷宫样的可用路径,而较大孔提供了更受限制且更直接的路径,用于多肽移动至废物室。如图1所示,系统20包括反应室24、废物室26和多孔基质30。反应室24包括具有端口34以接收含有靶分析物(A)52和蛋白降解产物(PDP)54的样品50的腔室(示意性显示)。反应室24含有多肽合成酶60(在图中用“E”示意性说明)。基于待分析的样品50中的靶分析物52的特征来特定地选择酶60。特定地选择酶60以便与PDP54反应以形成多肽,同时不与分析物52反应以形成多肽。不同的蛋白合成酶60的实例包括,但不限于,蛋白酶诸如胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶等。根据靶分析物60,可以利用其他多肽合成酶60。在一些实施方式中,反应室24可以含有其他元件,诸如酶辅因子、助溶剂和缓冲液。酶辅因子是催化酶和PDP54之间的反应的非蛋白分子。酶辅因子的实例包括,但不限于,铜离子。助溶剂包含悬浮酶60并溶解其他物质以形成溶液的液体分子。在一个实施方式中,可以选择助溶剂以增强酶60与PDP54的反应性。在一个实施方式中,所述助溶剂可以是有机的。在其他实施方式中,所述助溶剂可以是含水的。助溶剂的实例包括,但不限于,甘油。缓冲液包含作为溶液的一部分抑制溶液的pH变化的分子。此类缓冲液可以充当将pH保持在几乎恒定值的手段。缓冲液的实例包括,但不限于,磷酸盐缓冲液。可以选择酶辅因子、助溶剂和缓冲液中的每一种以促进有利于形成、而不是断裂酰胺键以形成多肽的热力学条件。在一个实施方式中,反应室24预先填充酶60以及酶辅因子、助溶剂和缓冲液,其中然后将反应室24“工厂密封(factorysealed)”,直至使用。在一个实施方式中,可以标记系统20,用于与特定类型的样品50、特定类型的PDP54和/或特定类型的靶分析物52一起使用,其中废物室24预先填充适当量和相对量的所选的一种或多种酶60以及最适合于特定类型的样品50、特定类型的PDP54和/或特定类型的靶分析物52的各自的辅因子、助溶剂和缓冲液。作为结果,可以特定地调整反应室24内具有预先填充的溶液混合物的不同组合的不同的系统20,用于排除特定PDPs54、特定氨基酸和/或寡肽。因为系统20可以在受控的制造规范下大规模生产,可以在范围上减小或消除单独制备酶促“鸡尾酒”的任务,潜在地减少技术人员错误。此外,减少与单独制备纯化样品50的溶液相关的时间和成本。因为系统20是独立的(self-contained),所以系统20可以改为便携式应用。多孔基质30包括在反应室24内布置或在反应室24内含有的一种或多种材料的网格或基质。多孔基质30包括互相连接的内部空间或体积(称为小室或孔)的基质。在所示实例中,多孔基质30包括开放小室孔70和开放小室孔72。开放小室孔70(由较小尺寸八角形示意性代表)彼此互相连接并连接至孔72。开放小室孔70的尺寸设定为接收样品50的靶分析物52,但排除由PDP54和酶60的反应产生的多肽。开放小室孔70的尺寸设定为使样品50的PDP54(氨基酸和寡肽)可进入,但随后形成的多肽不可进入。孔70的确切尺寸可以根据经验确定,并且可以取决于样品50的靶分析物52的特定尺寸特征以及将使用酶60从PDP54形成并从反应室24排出的多肽的预期尺寸。如图1所示,孔70如果没有含有大多数酶60的话,也含有大量的酶60。在一个实施方式中,酶60在不同孔70之间和不同孔70中移动。由于相对大量的孔70,酶60被熵驱动地诱捕在反应室24内。开放小室孔72(由较大八角形示意性代表)彼此互相连接并散布在孔70中。孔72尺寸大于孔70。孔72尺寸被设定为等于或大于将由PDP54和酶60的反应形成的多肽的预期分子尺寸。至少一些孔72彼此互相连接,以便形成一系列或一连串的互相连接的孔72。一连串互相连接的孔72形成多肽通道76,其从反应室24的内部延伸至废物室26。在一个实施方式中,至少一个多肽通道76,且在一个实施方式中,至少大部分多肽通道76,从废物室26延伸跨越基质30的至少50%的长度,且在一个实施方式中延伸跨越基质30的至少90%的长度,垂直地(orthogonally)远离废物室26,以便到达远离废物室26的基质30的更远端区域。每个多肽通道76促进形成的多肽在产生多肽时运输出反应室24并进入废物室26,促进室24内的形成的多肽和酶60之间的持续的非平衡状态。在一个实施方式中,通过在反应室24中提供足够密度的孔72(每单位体积孔72的数量)以增加孔72将相互连接且将形成到达废物室26的多肽通道76的可能性,以随机方式实现孔72的互相连接以形成多肽通道76。在一个实施方式中,孔70包括至少10%且不大于95%的基质30,且其本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.酶促样品纯化器,其包括:废物室;含有多肽合成酶、酶辅因子和助溶剂的反应室,所述反应室具有接收包含蛋白降解产物的样品的端口;在所述反应室内的多孔基质,其中所述多孔基质包括具有第一尺寸的第一孔和具有比所述第一尺寸大的第二尺寸的第二孔,所述第一尺寸小于待形成的多肽的分子尺寸,所述第二孔大于待形成的多肽的分子尺寸,所述第二孔与第一孔接触并形成从反应室内延伸至废物室的多肽通道。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.酶促样品纯化器,其包括:废物室;含有多肽合成酶、酶辅因子和助溶剂的反应室,所述反应室具有接收包含蛋白降解产物的样品的端口;在所述反应室内的多孔基质,其中所述多孔基质包括具有第一尺寸的第一孔和具有比所述第一尺寸大的第二尺寸的第二孔,所述第一尺寸小于待形成的多肽的分子尺寸,所述第二孔大于待形成的多肽的分子尺寸,所述第二孔与第一孔接触并形成从反应室内延伸至废物室的多肽通道。2.权利要求1的设备,其中所述第一孔包括至少10%且不大于95%的多孔基质。3.权利要求1的设备,其中所述第一孔包括至少80%且不大于95%的多孔基质。4.权利要求1的设备,其进一步包括场发生器,其用于施加场以加速形成的多肽通过一系列第二孔运输至废物室。5.权利要求4的设备,其中所述场发生器选自由以下组成的场发生器的组:电势梯度场发生器、热梯度场发生器、渗透梯度场发生器和压力梯度场发生器。6.权利要求1的设备,其进一步包括所述废物室内的缓冲液以抑制多肽分解。7.权利要求1的设备,其进一步包括在所述反应室和所述废物室之间的分隔件,所述分隔件对于大于所述第一尺寸的分子是可渗透的且对于小于所述第一尺寸的分子是不可渗透的,其中所述分隔件省略多肽合成酶。8.酶促样品纯化方法,其包括:将包含靶分析物和氨基酸的样品引入反应室的多孔基质中,所述多孔基质包括:含有与氨基酸反应以形成多肽的多肽合成酶的第一孔,所述第一孔具有可由蛋白退化产物进入、但不可由随后形成的多肽进入的第一...

【专利技术属性】
技术研发人员:V·什科尔尼科夫A·罗加奇
申请(专利权)人:惠普发展公司有限责任合伙企业
类型:发明
国别省市:美国,US

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