一种检测TLR4基因SNP位点rs2149356基因型的方法技术

本发明专利技术提供一种检测TLR4基因SNP位点rs2149356基因型的方法，步骤如下：构建重组阴性质粒和重组阳性质粒；提取待测样本的外周血基因组DNA，对重组阴性质粒、重组阳性质粒和待测样本的DNA均进行PCR扩增和HRM分析，收集数据；根据收集数据绘制高分辨率熔解曲线，根据重组阴性质粒、重组阳性质粒的熔解曲线判断待测样本TLR4基因SNP位点rs2149356的基因型。本发明专利技术的方法能够准确检测TLR4基因SNP位点rs2149356的基因型，灵敏度高，特异性好，检测迅速；应用本发明专利技术的方法对TLR4基因SNP位点rs2149356基因型的分型与测序结果完全一致，能够用于痛风易患性的辅助判断。

A method for detecting rs2149356 genotype of SNP locus in TLR4 gene

The present invention provides a method for detecting the rs2149356 genotype of the SNP locus of TLR4 gene. The steps are as follows: constructing a recombinant negative plasmid and a recombinant positive plasmid, extracting the genomic DNA of the peripheral blood of the samples to be measured, using PCR amplification and HRM analysis for the recombinant negative plasmids, recombinant positive plasmids and the DNA of the samples to be measured, and collecting the data; According to the collected data, the high resolution fusion curve was plotted and the genotype of the SNP locus rs2149356 of the TLR4 gene was determined according to the fusion curve of the recombinant negative plasmids and recombinant positive plasmids. The method of the invention can accurately detect the genotype of the SNP locus rs2149356 of the TLR4 gene, with high sensitivity, good specificity and rapid detection. The typing of the rs2149356 genotype of the SNP locus of the TLR4 gene is in full agreement with the sequencing results, and can be used for the auxiliary judgment of gout susceptibility.

【技术实现步骤摘要】
一种检测TLR4基因SNP位点rs2149356基因型的方法
本专利技术涉及一种检测TLR4基因rs2149356基因型的方法。
技术介绍
Toll样受体(Tolllikereceptor,TLR)家族成员TLR4(toll-likereceptor4)含有879个氨基酸，该基因定位于9号染色体短臂上。TLR是一种I型跨膜蛋白，由胞外富含亮氨酸重复序列结构域，胞内保守的Toll/IL-1受体结构域和跨膜结构域构成。TLR4是Toll样受体家族中与脂代谢密切相关，并且在目前研究较深入的一个成员，其信号通路被激活后，引发多种炎症因子的转录与合成，影响着机体脂代谢过程。相关研究表明，TLR4/NF-κB信号通路可能是将先天性免疫、脂肪代谢、胰岛素抵抗、血管炎症和动脉粥样硬化联系起来的中间桥梁。原发性高尿酸血症患者外周血单个核细胞中TLR4信号及相关致炎和抗炎因子表达异常，TLR4可能通过调节免疫反应参与原发性高尿酸血症患者病程的发生与发展。人群中位于TLR4外显子的rs2149356(c.261-468T>G)与尿酸盐水平和痛风具有相关性，而该多态G/G基因型频率与不同群体的痛风发生中均有相关性。痛风(Gout)是由嘌呤代谢紊乱和肾小管源性的尿酸排泄障碍而引起关节及某些器官损害的一种代谢疾病。随着人们生活水平的提高和饮食结构的改变，发病年龄有年轻化的趋势。研究显示，欧美地区痛风发病率为0.20％-1.70％，亚洲地区近年来痛风患病率明显升高，我国男性患病率为1.26％-1.59％。痛风早期的临床表现为间断发作性急性关节炎，主要为单关节受累，肿痛一般持续7-10天，可通过药物或自发缓解，间歇期无症状。随着病程的延长，痛风发作次数、受累关节数逐渐增加，间歇期也开始出现症状，同时关节或皮肤软组织中痛风石形成，严重者出现关节毁损或致残，出现肾脏结石、慢性肾损伤等，最终可能发展成慢性肾功能衰竭。高尿酸血症(Hyperuricemia，HUA)是高血压(HTN)、心血管疾病(CD)和慢性肾脏疾病(CKD)的高危因素痛风的发生发展有关。大量研究表明痛风是一种由环境和遗传因素共同作用引起的多基因遗传病，目前已知的痛风相关基因有ABCG2、TLR4、RFX3等。高尿酸血症患者TLR4信号及其相关的细胞因子表达变化，对于高尿酸血症病程的进展，炎症反应有着重要的作用；HUA是痛风发生的最重要的生化基础和最直接病因。研究发现高尿酸血症人群中仅有10％左右的人可能发展成痛风，说明不直接参与尿酸代谢的基因也可能与痛风易感性有关。鉴于痛风对患者引起的严重危害和沉重的负担，对痛风易感基因的筛查和研究日益受到人们的关注。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供了一种检测样品中TLR4基因SNPrs2149356(c.261-468T>G)基因型的HRM方法。本专利技术还公开了用于扩增和检测样品TLR4基因SNPrs2149356的引物序列。本申请人设计了一种检测TLR4基因SNPrs2149356基因型的方法，用来检验TLR4基因SNPrs2149356的基因型，该结果可用于TLR4基因SNPrs2149356相关的痛风易患性风险评估。本专利技术的第一个目的是提供一种检测TLR4基因SNP位点rs2149356基因型的方法，步骤如下：(1)构建重组阴性质粒和重组阳性质粒：所述重组阴性质粒的核苷酸序列为序列表中SEQIDNo.3，所述重组阳性质粒的核苷酸序列为序列表中SEQIDNo.4；(2)提取待测样本的外周血基因组DNA，对重组阴性质粒、重组阳性质粒和待测样本的DNA均进行PCR扩增和HRM分析，收集数据；作为优选，所述HRM分析的条件为：94℃90s；60℃30s；83-94℃收集数据，温度上升速率为0.06℃/s；(4)根据收集数据绘制高分辨率熔解曲线，根据重组阴性质粒、重组阳性质粒的熔解曲线判断待测样本TLR4基因SNP位点rs2149356的基因型：与重组阴性质粒的熔解曲线重合则TLR4基因SNP位点rs2149356的基因型为TT；与重组阳性质粒的熔解曲线重合则TLR4基因SNP位点rs2149356的基因型为GG；在重组阴性质粒和重组阳性质粒之间的则TLR4基因SNP位点rs2149356的基因型为TG。作为优选，所述PCR扩增时所用引物为(1)-(3)中的一种：(1)上游引物：TLR4-F5'-AGCATTTACCTCTGATAACAAGAAC-3'下游引物：TLR4-R5'-AGTTGGTAGCCAAGATAAATGACT-3'(2)与(1)中的互补序列；(3)将(1)中的序列向5’端和/或3’端方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列。作为优选，所述PCR扩增时的反应体系为：作为优选，所述PCR扩增时的反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性10s；60℃退火/延伸20s；40个循环。本专利技术的第二个目的是提供一种用于检测TLR4基因SNP位点rs2149356基因型的试剂盒，所述试剂盒包括重组阴性质粒、重组阳性质粒和用于扩增重组阴性质粒和重组阳性质粒的引物；所述重组阴性质粒的核苷酸序列为序列表中SEQIDNo.3，所述重组阳性质粒的核苷酸序列为序列表中SEQIDNo.4。作为优选，所述引物序列为(1)-(3)中的一种：(1)上游引物：TLR4-F5'-AGCATTTACCTCTGATAACAAGAAC-3'下游引物：TLR4-R5'-AGTTGGTAGCCAAGATAAATGACT-3'(2)与(1)中的互补序列；(3)将(1)中的序列向5’端和/或3’端方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列。作为优选，所述PCR扩增时的反应体系为：作为优选，所述扩增质粒时的PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性10s；60℃退火/延伸20s；40个循环。本专利技术的第三个目的是提供上述试剂盒的使用方法，步骤如下：(1)提取待测样本的外周血基因组DNA，对重组阴性质粒、重组阳性质粒和待测样本的外周血基因组DNA均进行PCR扩增和HRM分析：所述HRM分析的条件为：94℃90s；60℃30s；83-94℃收集数据，温度上升速率为0.06℃/s；(2)根据收集数据绘制高分辨率熔解曲线，根据重组阴性质粒、重组阳性质粒的熔解曲线判断待测样本TLR4基因SNP位点rs2149356的基因型：与重组阴性质粒的熔解曲线重合则TLR4基因SNP位点rs2149356的基因型为TT；与重组阳性质粒的熔解曲线重合则TLR4基因SNP位点rs2149356的基因型为GG；在重组阴性质粒和重组阳性质粒之间的则TLR4基因SNP位点rs2149356的基因型为TG。本专利技术的第四个目的是提供序列表中SEQIDNo.1和序列表中SEQIDNo.2在制备检测TLR4基因SNP位点rs2149356基因型的试剂盒中的应用。本专利技术的第五个目的是提供序列表中SEQIDNo.1、序列表中SEQIDNo.2、权利要求5-8任一所述的试剂盒在制备辅助评估痛风易患性试剂中的应用。本专利技术的方法能够准确检测TLR4基因SNP位点rs2149356的基因型，灵敏度高，特异性好，检测迅速；应用本专利技术的方法对TLR4基因本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测TLR4基因SNP位点rs2149356基因型的方法，其特征在于：步骤如下：(1)构建重组阴性质粒和重组阳性质粒：所述重组阴性质粒的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.3，所述重组阳性质粒的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.4；(2)提取待测样本的外周血基因组DNA，对重组阴性质粒、重组阳性质粒和待测样本的DNA均进行PCR扩增和HRM分析，收集数据；作为优选，所述HRM分析的条件为：94℃ 90s；60℃ 30s；83‑94℃收集数据，温度上升速率为0.06℃/s；(3)根据收集数据绘制高分辨率熔解曲线，根据重组阴性质粒、重组阳性质粒的熔解曲线判断待测样本TLR4基因SNP位点rs2149356的基因型：与重组阴性质粒的熔解曲线重合则TLR4基因SNP位点rs2149356的基因型为TT；与重组阳性质粒的熔解曲线重合则TLR4基因SNP位点rs2149356的基因型为GG；在重组阴性质粒和重组阳性质粒之间的则TLR4基因SNP位点rs2149356的基因型为TG。

【技术特征摘要】
1.一种检测TLR4基因SNP位点rs2149356基因型的方法，其特征在于：步骤如下：(1)构建重组阴性质粒和重组阳性质粒：所述重组阴性质粒的核苷酸序列为序列表中SEQIDNo.3，所述重组阳性质粒的核苷酸序列为序列表中SEQIDNo.4；(2)提取待测样本的外周血基因组DNA，对重组阴性质粒、重组阳性质粒和待测样本的DNA均进行PCR扩增和HRM分析，收集数据；作为优选，所述HRM分析的条件为：94℃90s；60℃30s；83-94℃收集数据，温度上升速率为0.06℃/s；(3)根据收集数据绘制高分辨率熔解曲线，根据重组阴性质粒、重组阳性质粒的熔解曲线判断待测样本TLR4基因SNP位点rs2149356的基因型：与重组阴性质粒的熔解曲线重合则TLR4基因SNP位点rs2149356的基因型为TT；与重组阳性质粒的熔解曲线重合则TLR4基因SNP位点rs2149356的基因型为GG；在重组阴性质粒和重组阳性质粒之间的则TLR4基因SNP位点rs2149356的基因型为TG。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增时所用引物为(1)-(3)中的一种：(1)上游引物：TLR4-F5'-AGCATTTACCTCTGATAACAAGAAC-3'下游引物：TLR4-R5'-AGTTGGTAGCCAAGATAAATGACT-3'(2)与(1)中的互补序列；(3)将(1)中的序列向5’端和/或3’端方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增时的反应体系为：4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增时的反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性10s；60℃退火/延伸20s；40个循环。5.一种用于检测TLR4基因SNP位点rs2149356基因型的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括重组阴性质粒、重组阳性质粒和用于扩增重组阴性质粒和重组阳性质粒...

【专利技术属性】
技术研发人员：车团结，徐红，陈游，杨震，李亚鹏，
申请(专利权)人：苏州百源基因技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32