培养细胞的方法技术

描述了培养自体细胞的方法以及治疗哺乳动物患者的方法。细胞培养在基质材料上，该基质材料具有用脂肪酸酯处理的表面以便具有强疏水表面，并且从患者的血液样品中获得的自体血浆用作生长培养基来培养细胞。基质材料也用作用于将培养的细胞转移至患者的转移敷料，以及用作伤口覆盖敷料。本发明专利技术还描述了使用该培养方法来培养自体细胞的试剂盒以及系统。

Methods of cell culture

Methods of culture of autologous cells and methods for treatment of mammalian patients are described. The cell culture is on the matrix material, the matrix material has a fatty acid ester surface to have a strong hydrophobic surface, and the autologous plasma obtained from the blood samples of the patient is used as a growth medium to culture the cells. Matrix materials are also used to transfer cultured cells to patients' transfer dressings and wound dressing. The invention also describes a kit and a system for culturing autologous cells using the culture method.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】培养细胞的方法
本专利技术涉及培养细胞的方法，且特别涉及培养用于制备培养的上皮自体移植物(epithelialautograft)(CEA)的自体细胞的方法，以及通过移植由本专利技术方法培养的自体细胞来治疗哺乳动物患者的方法，且特别用于治疗烧伤受害者。
技术介绍
第一种培养的上皮自体移植物(CEA)由Rheinwald和Green实现(Serialcultivationofstrainsofhumanepidermalkeratinocytes:theformationofkeratinizingcoloniesfromsinglecells,Cell.1975,6:331-344)。自此来自培养的细胞的皮肤移植物被频繁地使用于治疗皮肤缺陷，诸如烧伤。然而，还存在一些没有完全解决的相关缺点，诸如例如，易碎的表皮片和在将移植物从培养环境转移到患者期间可能持续的结构损伤、“移植物成活率(grafttake)”差和微生物污染等。市售的培养的上皮自体移植物(CEA)产品诸如EPICEL已充分用于治疗严重的烧伤受害者。市售产品潜在的问题是它们使用的动物产品可能并不总是与人类患者能免疫相容。如EPICEL的产品已经克服了那些相容性问题中的一些，但以巨大的代价使得该产品过于昂贵，特别是在像非洲和其他第三世界国家的地区，在那里患者难以负担基本的保健治疗。在市售产品不易获得的地方，可能需要在当地培养皮肤。考虑到在运输此类移植细胞期间无菌性和结构完整性的实际担忧，合适的实验室与医院的距离使得这并不总是可行的选择。Barlow(美国专利No6,039,972)描述了一种适形的伤口敷料，其通过生产锚定于合成聚合物膜表面的培养的上皮细胞的亚汇合层来制备，该合成聚合物膜是疏水的、对细胞生长无抑制性并且无细胞毒性。该膜需要在细胞培养之前或之后通过穿孔形成的孔。细胞的生长发生在通常使用的含有胎牛血清的生长培养基中。Rennekampf等人(Woundclosurewithhumankeratinocytesculturedonapolyurethanedressingoverlaidonaculturedhumandermalreplacement,Surgery,1996,120:16-22)描述了在聚氨酯片上将人角质细胞(HK)片培养成单层，其是合成的亲水敷料。HK是从人类尸体供体皮肤获得的，且只有61％的受试动物实现了阳性移植物成活率。VanDorp等人(Amodifiedculturesystemforepidermalcellsforgraftingpurposes:aninvitroandinvivostudy,WoundRepairRegen.1999,7(4):214-225)在聚酯填料基质上培养了人类和猪的表皮角质细胞。然而，他们发现，成功的上皮再生只在细胞片通过使用分散酶(Dispase)酶处理而随之从基质脱附时才可能。已知使用分散酶酶促脱附能损坏可用于伤口愈合过程的某些细胞。Hernon等人(Clinicalexperienceusingculturedepithelialautograftsleadstoanalternativemethodologyfortransferringskincellsfromthelaboratorytothepatient,RegenerativeMed.2006,1(6):809-821)描述了将化学限定的表面用于角质细胞的培养，其随后可以转移到伤口床，而不需要将细胞从表面酶促脱附。然而，该方法需要相当复杂的等离子体聚合的额外步骤，其中含有酸基的材料沉积在商业医疗级聚合物上。该材料以气相引入，并通过在低真空场上施加电压产生等离子体能量场。Atiyeh和Costagliola(CulturedEpithelialautograft(CEA)inburntreatment:Threedecadeslater,Burns,2007,33:405-413)描述了使用新递送系统，通过在可移植膜(诸如合成聚合物)上生长细胞来转移角质细胞，该可移植膜可以直接转移到伤口床。然而，这些聚合物对培养的细胞的质量的影响尚未得到充分评估。Chua等人(InvitroevaluationoffibrinmatandTegadermTMwounddressingforthedeliveryofkeratinocytes-Implicationsoftheirusetotreatburns,Burns,2008,34:175-180)描述了使用TegadermTM(一种基于聚氨酯的伤口敷料)作为细胞生长的基质。细胞生长在含有10％胎牛血清的生长培养基中辐照的3T3-J2细胞的饲养层上，并且发现相比于在纤维蛋白垫上生长的细胞，在TegadermTM上生长的细胞显示出一些细胞较弱的表达，这通常为细胞提供了更好的环境。DeCorte等人(Feederlayer-andanimalproduct-freecultureofneonatalforeskinkeratinocytes:improvedperformance,usability,qualityandsafety,CellTissueBank,2012,13:175-189)提及硅酮膜递送技术作为递送亚汇合细胞的方式，同时还提供伤口覆盖物。Dahlquist(美国专利No.8,658,851)和Iwamoto等人(EP1637145)描述了在包括疏水聚合物的柔性支撑物上生长的细胞，并使用源自需被治疗的受试者的细胞来避免不利的免疫反应。Falk和Ivarsson(EffectofaDACCdressingonthegrowthpropertiesandproliferationrateofculturedfibroblasts,JournalofWoundCare,2012,21(7):327-332)研究了使用实验性体外伤口模型的人类真皮成纤维细胞的形态和增殖。然而，他们仅使用市售的成纤维细胞而没有使用其他皮肤细胞成分，如在活皮肤移植中所需的表皮细胞和真皮细胞。他们还使用了含有10％胎牛血清的生长培养基。Smith(US2013/0072565)也使用了疏水基质，诸如二烷基氨基甲酰氯(DACC)或烷基烯酮二聚体(优选与载体相关联的)来增加细胞增殖，以用于使用市售的补充有10％小牛血清的生长培养基来生长市售的人真皮成纤维细胞。DeMoraes等人(Useofautologousfibringlueindermatologicsurgery:applicationofskingraftandsecondintentionhealing,RevPaulMed,1998,116(4):1747-1752)描述了使用自体血液样品生产纤维蛋白胶(作为皮肤移植物中的组织粘合剂)。Mishra(美国专利申请No.2007/0122906)描述了在细胞培养基中使用血液成分诸如富血小板血浆(PRP)来生长和增殖细胞。然而，所述细胞的唯一支撑(用来将细胞保持在一起并指导成熟组织发育)是胶原，其通常提取自动物幼崽的组织，且可能由此导致患者的免疫相容性问题。Scude本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种培养用于治疗哺乳动物患者的自体细胞的方法，步骤包括：a.提供具有用脂肪酸酯处理的表面以具有强疏水表面的基质材料；b.将从患者获得的细胞置于所述基质材料的所述疏水表面上，以便在其上培养自体细胞；以及c.将从所述患者的血液样品中获得的自体血浆作为生长培养基施用于所述细胞来培养所述细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种培养用于治疗哺乳动物患者的自体细胞的方法，步骤包括：a.提供具有用脂肪酸酯处理的表面以具有强疏水表面的基质材料；b.将从患者获得的细胞置于所述基质材料的所述疏水表面上，以便在其上培养自体细胞；以及c.将从所述患者的血液样品中获得的自体血浆作为生长培养基施用于所述细胞来培养所述细胞。2.如权利要求1所述的方法，其中，所述基质材料用作将培养的细胞转移至所述患者的转移敷料。3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中，所述基质材料还用作伤口覆盖敷料。4.如前述权利要求任一项所述的方法，其中，所述基质材料包括醋酸纤维素、棉纱布或无纺布并且脂肪酸选自二烷基氨基甲酰氯(DACC)和烷基烯酮二聚体(AKD)。5.如权利要求4所述的方法，其中，所述DACC是双十六烷基氨基甲酰氯或双十八烷基氨基甲酰氯。6.如前述权利要求任一项所述的方法，其中，所述细胞选自包括成纤维细胞和黑素细胞的皮肤细胞或上皮细胞。7.如前述权利要求任一项所述的方法，其中，所述血浆是富血小板血浆(PRP)。8.如前述权利要求任一项所述的方法，所述方法包括至少每2至4天，用水凝胶润湿所述细胞的另一步骤。9.一种通过移植体外培养的自体细胞治疗哺乳动物患者的方法，包括以下步骤：a.从所述患者的活组织检查中获得细胞；b.提供具有用脂肪酸酯处理的表面以便具有强疏水表面的基质材料；c.将所述细胞置于所述基质材料上并在其上培养自体细胞，使用从所述患者的血液样品中获得的自体血浆作为生长培养基来培养所述细胞；d.将自体培养的细胞移植到所述患者上，使用所述基质材料作为转移敷料和伤口覆盖敷料。10.一种用于培养用于治疗哺乳动物患者的自体细胞的试剂盒，所述试剂盒包括：a.用于分离从患者获得的活组织检查的表皮细胞和真皮细胞的胰蛋白酶溶液或溶液前体b.具有用脂肪酸酯处理的表面以具有强疏水表面的基质材料，并且在所述表面上可以放置细胞以便在其上培养自体细胞；以及c.用于容纳从所述患者的血液样品中获得的血浆的多个管。11.如权利要求10所述的试剂盒，还包括用于从所述患者获得的血液样品中提取血浆的多个注射器；多个无菌针和15/0刀片(手术室...

【专利技术属性】
技术研发人员：韦恩·乔治·克莱因特耶斯，
申请(专利权)人：斯坦陵布什大学，
类型：发明
国别省市：南非,ZA